먼저, 안락사된 쥐의 장간막 림프관을 분리하고 캐뉼레이팅합니다. 증식 챔버에서 림프관에 압력을 가하고 림프관이 평형을 이루고 안정적인 자발적 수축을 발달시킬 수 있도록 합니다. 그런 다음 어두운 곳에서 30분 동안 Fura-2-acetoxymethyl ester와 pluronic acid로 림프관을 배양합니다.
배양 후 음압 진공 청소기로 전체 수조 부피를 비우고 온도에 맞는 시약이 없는 생리염 용액을 세 번 다시 채웁니다. 그런 다음 림프관을 어둠 속에서 추가로 15분 동안 배양하여 과도한 지시자를 제거하고 에스테르 제거를 허용합니다. 챔버를 LED 조명, 20XS 형광 대물렌즈, 자체 프레이밍 어댑터 및 15Hz 형광 캡처용 카메라가 있는 도립 형광 현미경으로 옮깁니다.
현미경을 이미징 소프트웨어가 장착된 컴퓨터에 연결하여 형광을 기록하고 가장자리 감지를 수행합니다. LED 광원과 형광등 시스템 인터페이스를 활성화합니다. 이제 IonWizard 소프트웨어를 시작하십시오.
파일 탭에서 새로 만들기 옵션을 선택합니다. 그런 다음 수집 탭으로 이동하여 실험을 선택합니다. 원하는 실험 템플릿을 로드하고 OK를 클릭합니다. 화면 하단에 있는 시작 버튼을 클릭하여 실험을 시작합니다.
다음으로, 용기 직경, 분자, 340 신호, 분모, 380 신호 및 비율을 내림차순으로 표시하도록 화면의 트레이스를 조정합니다. 더 나은 추적 시각화를 위해 Y축 스케일을 수정하려면 Traces(추적)로 이동하여 Automatic Limits(자동 제한)가 선택 취소되어 있는지 확인하고 Edit User Limits(사용자 제한 편집)를 선택합니다. 조정할 매개변수를 선택하고 축의 최소값과 최대값을 입력한 다음 확인을 선택하여 확인합니다.
가장자리 감지 소프트웨어를 사용하여 림프관 벽이 어두운 선으로 나타나도록 조명을 조정합니다. 지방과 파편이 없는 관심 영역 또는 ROI를 선택하고 이 ROI를 이동시키지 않도록 합니다. 전체 수축 주기 동안 선박 벽 가장자리가 감지되도록 임계값을 설정합니다.
광전자 증배관을 활성화한 후 LED 조명기를 사용하여 340 및 380 나노미터 파장과 50밀리초 노출을 번갈아 가며 Fura-2를 여기시킵니다. 전체 이미징 필드에서 510나노미터 및 15헤르츠의 방출 스펙트럼을 캡처합니다. 신호 대 배경 비율을 측정하려면 먼저 시야 중앙에 림프관이 있는 340 및 380 형광을 얻습니다.
그런 다음 배경을 캡처할 용기가 없는 욕조 가장자리로 시야를 이동합니다. 그 후, 수조 용액을 온도에 맞는 시약이 없는 생리염 용액으로 교체하여 과도한 Fura-2 지시약을 제거합니다. 약 30분 동안 기준선 Fura-2 형광 신호와 자발적 수축을 기록합니다.
그런 다음 Nifedipine의 누적 농도 반응을 기록하고 각 약물 농도에 대한 배경 측정값을 얻습니다. 각 실험이 끝나면 온도에 맞는 무칼슘 생리염 용액으로 림프관을 세척하여 칼슘 이온이 없는 경우 림프관의 최소 Fura-2 형광 신호와 최대 직경을 얻습니다. 수조 용액을 10밀리몰 칼슘 이온과 이오노마이신을 함유한 온도에 맞는 생리염 용액으로 교체하여 칼슘 이온이 포화된 조건에서 최대 Fura-2 형광 신호와 림프관의 최소 직경을 얻습니다.
칼슘 스파이크 진폭, 기준선 칼슘 및 피크 칼슘을 포함한 매개변수는 관류 챔버에 니페디핀을 증분 추가함으로써 농도 의존적 감소를 나타냈습니다. 동시에 수축, 진폭 및 계산된 유량과 같은 수축 매개변수도 단계적 감소를 보여주었습니다. 맨해튼 플롯은 간격, 수축 시간 및 이완 시간을 포함한 리듬 측정에 대한 개별 림프관 반응을 보여주었습니다.
