시작하려면 인큐베이터와 연동 펌프의 모든 영역을 소독제로 철저히 청소하여 준 멸균 환경을 보장합니다. 그런 다음 마그네슘과 칼슘이 함유된 700마이크로리터의 PBS로 각 튜브를 세척한 다음 500마이크로리터의 C2 또는 EC 컨디셔닝 매체를 플러시합니다. 왼쪽 캐비티의 경우 루어 잠금 장치에서 연동 펌프 스토퍼까지의 거리가 짧은 튜빙을 사용하고 오른쪽 캐비티의 경우 다른 대칭이 있는 튜빙을 사용하십시오.
인큐베이터에서 HUVEC 및 C2BBe1 세포가 있는 바이오칩을 회수한 후 각 챔버에 대해 350마이크로리터로 배지 교환을 수행합니다. 그런 다음 플러그를 아래쪽에서 위쪽 위치로 이동합니다. 350 마이크로 리터의 신선한 매체를 바이오 칩의 하부 챔버에 추가하십시오.
그런 다음 모든 플러그를 제거하고 모든 포트를 맨 위까지 채우십시오. 왼쪽 캐비티에서 시작하여 루어 잠금 어댑터를 바이오칩의 포트에 삽입하여 첫 번째 튜브를 상부 챔버의 오른쪽 포트에 연결합니다. 그런 다음 두 번째 튜브를 하부 챔버의 왼쪽 포트에 연결합니다.
다음으로, 저장소를 가져 와서 저장소 바닥에 세포 배양 배지 소량 방울을 추가합니다. 그런 다음 저장소를 첫 번째 튜브의 반대쪽에 삽입하고 다른 챔버에 대해 반복합니다. 모든 포트가 튜브 또는 저장소에 연결되면 저장소에 3.5mL의 세포 배양 배지를 채웁니다.
그런 다음 뚜껑이 부착된 튜브의 느슨한 면을 저장소 상단에 놓아 각 챔버의 미세유체 시스템을 닫습니다. 바이오칩을 연동 펌프로 운반합니다. 연동 펌프 스토퍼를 사용하여 각 튜브를 연동 펌프에 연결하여 매체가 저장소에서 캐비티로 흐르고 펌프를 통해 다시 흐르도록 합니다.
그런 다음 각 챔버에 분당 50마이크로리터의 유속으로 관류합니다. 사전 주입이 완료되면 연동 펌프를 중지합니다. 각 저장소의 튜브에 연결된 뚜껑을 제거하고 펌프 옆의 멸균 조직에 놓습니다.
모든 매체를 제거한 후 신선하게 준비된 매체 2ml로 저장소를 채웁니다. 튜브와 뚜껑을 다시 연결하고 추가 50시간 동안 분당 24마이크로리터의 유속으로 원형 관류를 계속합니다. 연동 펌프가 중지되면 모든 캐비티의 저장소를 엽니다.
저장소를 비우고 바이오칩에서 튜브와 저장소를 분리합니다. 챔버당 두 번 마그네슘과 칼슘이 포함된 500마이크로리터의 차가운 PBS로 미세유체 캐비티를 세척합니다. 모든 충치에 500마이크로리터의 얼음처럼 차가운 메탄올을 추가합니다.
칩을 개봉한 후 바이오칩의 접착 호일을 자르거나 제거합니다. PET 멤브레인이 포함된 조직을 반으로 잘라 다른 면역 패널과 평행하게 염색합니다. 정밀 핀셋을 사용하여 각 멤브레인 조각을 차단 및 투과성 용액이 있는 24웰 플레이트의 별도 웰로 옮깁니다.
그런 다음 멤브레인 조각을 습한 챔버 내부의 깨끗한 유리 슬라이드로 옮깁니다. 50 마이크로리터의 준비된 1차 항체 및 염색 용액을 각 멤브레인 조각에 추가합니다. 샘플을 24웰 플레이트로 옮기면 세척 용액으로 멤브레인을 5분 동안 두 번 세척한 다음 마그네슘과 칼슘이 포함된 PBS로 세척합니다.
형광 장착 매체와 커버 유리를 사용하여 멤브레인 조각을 깨끗한 유리 슬라이드에 장착하고 현미경 이미징까지 섭씨 4도에서 보관합니다. 5일간의 주입 후, DAPI로 염색된 핵 DNA는 CD68을 발현하는 완전히 분화된 단핵구 유래 대식세포가 혈관 조직 전체에 퍼져 있음을 보여주었습니다. HUVEC은 VE-cadherin과 같은 부착 접합부(adherence junctions)의 형성에 의해 조직 무결성을 보여주는 합류층(confluent layer)을 생성했습니다.
또한 폰 빌레브란트 요인은 HUVEC에 의해 많이 표현됩니다. 5일간의 증식 후, C2BBe1 세포는 접합 단백질 E-cadherin 및 ZO-1을 발현하는 분극화된 상피 세포층을 형성했습니다. 상피의 융모와 같은 및 크립트와 같은 구조의 3차원 성장은 6일간의 관류 후 Z-스택의 x 및 y 섹션에서 감지할 수 있습니다.
