10% FBS가 보충된 DMEM이 있는 6개의 웰 플레이트에서 웰당 5회 10에서 5번째 DF-1 세포를 배양하기 시작합니다. 세포가 80% 합류점에 도달하면 세포 배양 배지가 포함된 혈청을 폐기합니다. PBS로 세포를 세 번 세척한 후 무혈청 세포 배양 배지 2mL를 첨가한 다음 각 웰에 IBDV 바이러스 용액을 추가합니다.
1시간 동안 바이러스를 흡수한 후 PBS로 세포를 3회 세척하고 2%FBS가 보충된 DMEM 2mL로 24시간 동안 배양합니다. 웰당 500마이크로리터의 트립신을 추가한 다음 1분 후에 10%FBS로 2밀리리터의 DMEM을 추가합니다. 세포를 원심분리하고 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
PBS에서 세포 펠릿을 재현탁시킨 후 튜브를 3초 동안 부드럽게 소용돌이치고 앞에서 설명한 대로 세포를 원심분리합니다. 현미경 아래의 혈구계를 사용하여 세포를 계수하여 적절한 양의 유세포 분석 염색 완충액에 재현탁시키고 현탁액을 소용돌이칩니다. 100 마이크로리터의 단일 셀 현탁액을 5 밀리리터의 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에 추가합니다.
IBDV에 감염된 세포를 배양하고 모의 대조군 세포를 적절한 항체 1마이크로그램으로 어두운 곳에서 30분 동안 얼음 위에 올려 놓습니다. 10분마다 부드럽게 튜브를 소용돌이칩니다. 1mL의 유세포분석 염색 완충액으로 세포를 세척하고 튜브를 원심분리합니다.
상층액을 버린 후 펠릿을 100 마이크로리터의 유세포 분석 염색 완충액에 재현탁시킵니다. 그런 다음 프로피듐 요오드화물 밀리리터당 10마이크로그램으로 어두운 어두운 실온에서 10분 동안 세포를 배양합니다. 그리고 유세포 분석을 위해 400 마이크로리터의 유세포 분석 염색 완충액을 추가합니다.
모든 샘플을 실행하기 전에 blank control tube를 사용한 다음 단일 염색 튜브를 사용하여 전압 및 보상 매개변수를 조정하기 위해 유세포 분석을 수행합니다. 유세포 분석은 IBV 감염 후 닭 Gasdermin E의 N-말단 단편에 대해 상당한 수의 세포가 양성인 반면, 절단된 닭 Gasdermin E의 C-말단 단편은 막 표면 항원 염색을 사용한 유세포 분석으로 거의 검출할 수 없는 것으로 나타났습니다. IBDV에 감염된 세포에서 닭 Gasdermin E 및 프로피듐 요오디드 이중 양성 세포의 N-말단 단편 개체군은 모의 감염 대조군보다 훨씬 많았으며, 이는 IBDV 감염 세포의 이 부분이 파이롭토시스를 겪고 있음을 시사합니다.
