먼저 오가노이드 유래 2D 단층 배양을 위해 세포 배양 삽입물에 세포외 기질을 코팅합니다. 100 마이크로리터의 세포외 매트릭스 코팅을 준비된 각 세포 배양 삽입물의 정점 챔버에 적용하고 뚜껑을 교체합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 이산화탄소 5%의 가습 인큐베이터에서 1시간 동안 세포 배양 플레이트를 배양합니다.
직장 오가노이드 세포의 경우 배양 후 세포외 기질 코팅을 직장 단층 배양 배지로 교체하고 하룻밤 동안 배양합니다. 오가노이드를 효소로 분해하고 단일 세포로 여과한 후 세포 현탁액을 200g에서 섭씨 4도에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 버립니다. 다음으로, 단층 배양 배지에 세포 배양 삽입물당 200마이크로리터의 세포 현탁액을 준비합니다.
세포외 기질 코팅된 세포 배양 삽입물이 들어 있는 24웰 세포 배양 플레이트를 검색합니다. 진공 흡입을 사용하여 코팅이 중단되지 않도록 각 세포 배양 삽입물의 정점 챔버를 조심스럽게 비웁니다. 200 마이크로리터의 단일 세포 현탁액을 각 세포 배양 삽입물의 정점 챔버에 조심스럽게 적용합니다.
적절하게 보충된 단층 배양 배지 500마이크로리터를 각 웰의 기저측 챔버에 추가합니다. 그런 다음 가습 인큐베이터에서 플레이트를 배양하여 세포 접착 및 성장을 촉진하고 세포 배양 삽입물에 합류 2D 단층을 형성합니다. 세포 파종 후 48시간 후부터 격일로 정점 챔버와 기저측 챔버의 배양 배지를 교체합니다.
오가노이드 유래 2D 단층의 면역형광 염색을 위해 메스 칼날로 세포 배양 삽입 멤브레인을 조심스럽게 잘라내고 세포 배양 삽입물을 유리 슬라이드에 놓습니다. 커버 슬립에 장착 매체를 추가하고 세포를 관찰하기 전에 유리 슬라이드에 놓습니다. 해리된 성숙한 오가노이드를 세포 배양 삽입물에 파종한 후 어느 날 2D 단층이 형성되는 것처럼 보였습니다.
주사 전자 현미경 검사는 파종 후 5일 후에 2D 단층의 정점 표면에서 잘 발달된 미세 융모와 세포 경계를 보여주었습니다. 2D 단층의 면역형광 염색을 통해 회장 및 직장 오가노이드 유래 2D 단층 모두에서 정점 브러시 경계, 기저외측 부착 접합부 및 점액 생성 잔 세포의 존재를 확인했습니다.
