인간 유방 상피 세포를 분리하기 위한 유방 조직의 소화

조직을 해리하는 것으로 시작하십시오. 두 쌍의 겸자를 사용하여 유방 조직에서 지방 조직을 제거합니다. 나머지 유방 조직의 무게가 약 1g인지 확인하십시오.

75% 에탄올 용액 5mL에 유방 조직을 5초 동안 헹굽니다. 그런 다음 20mL의 세척액으로 각각 5분씩 두 번 세척합니다. 그런 다음 두 개의 수술용 칼날을 사용하여 유방 조직을 더 작은 조각으로 자릅니다.

조직 균질액을 얻기 위해 15분 동안 연속적으로 파쇄된 조직을 50밀리리터 원심분리 튜브로 옮깁니다. 디스파제 및 콜라겐분해효소 용액 10밀리리터, 0.25%트립신 3밀리리터, PBS 7밀리리터를 첨가하여 총 20밀리리터의 소화 용액을 만듭니다. 튜브를 섭씨 37도의 수조에 넣고 1 1/2시간 동안 배양하고 20분마다 튜브를 흔듭니다.

소화 과정을 멈추려면 20ml의 중화 용액을 추가하십시오. 그런 다음 내용물이 완전히 섞이도록 내용물을 약 15회 피펫팅합니다. 100미크론 메쉬 필터를 통해 혼합물을 여과합니다.

그 후, 156G에서 5분 동안 원심분리합니다. 그런 다음 상층액을 제거합니다. 20 밀리리터의 중화 용액으로 펠릿을 반복 배양한 다음 피펫팅으로 혼합합니다.

다시 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 세포 펠릿을 10mL의 초기 배양 배지로 재현탁시킵니다. 세포 현탁액을 100mm 세포 배양 접시에 담습니다.

섭씨 37도의 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 세포를 배양합니다. 원래 배양 배지를 3일마다 새로운 상피 세포 배지로 교체합니다. 셀을 확인하고 이틀에 한 번씩 배지를 새로 고칩니다.

이 프로토콜을 사용하여 인간 유방 상피 세포를 유방 조직에서 분리했습니다. 분리 후 분석에서 ROCK 억제제 Y-27632로 처리된 세포는 대조군에 비해 뚜렷한 성장을 보였습니다. CCK-8 분석 결과 Y-27632를 함유한 배지의 세포가 대조 배지의 세포보다 훨씬 더 빠른 속도로 증식하는 것으로 나타났습니다.

면역형광 분석은 대부분의 세포가 유방 상피 세포 마커인 CK7 및 GATA3를 발현하고 후속 통로에서 다른 세포 유형의 존재를 무시할 수 있음을 확인했습니다. 또한, qRT-PCR 연구는 여러 통로에 걸쳐 CK7 및 GATA3의 일관된 발현 수준을 보여주었으며, 이는 일관된 표현형 또는 분화 능력을 나타냅니다.