시작하려면 E3 완충액에서 마취된 제브라피시 배아를 얻습니다. 원하는 형광을 가진 배아를 선택한 후 명시야 실체 현미경으로 배아의 심장 박동을 시각화합니다. 와이드 팁 전사 피펫을 사용하여 최대 3개의 배아를 추출하고 하단 유리 이미징 플레이트에 이식합니다.
실체 현미경 아래에서 피펫을 사용하여 배아 주변의 배지를 1% 저용융 아가로스 용액으로 교체합니다. 놀리는 바늘에 부착된 플라스틱의 얇은 테이퍼 팁을 사용하여 각 배아를 이미징 플레이트의 바닥으로 부드럽게 밀어 넣고 등쪽이 유리를 향하도록 합니다. 배아를 도립 컨포칼 현미경에 장착합니다.
타임랩스 획득 파라미터를 설정한 후 이미지를 획득합니다. Imaris 파일 변환기 소프트웨어를 열고 파일을 입력 영역으로 끌어다 놓습니다. [출력] 메뉴에서 변환된 파일의 위치를 지정합니다.
설정된 복셀 크기를 클릭하여 확인하고 모두 시작 버튼을 눌러 IMS 형식으로 파일 변환을 시작합니다. 실행되면 분석 소프트웨어가 경기장에서 시작되도록 합니다. Observe Folder를 클릭하여 이전에 변환된 파일을 엽니다.
파일이 소프트웨어에 로드되면 슬라이스 보기를 클릭하여 z 스택을 스크롤합니다. 슬라이스 도구 모음의 슬라이더를 사용하여 포인터로 선택한 셀의 지름을 그린 후 셀 지름을 측정합니다. 마우스를 클릭하고 끌어 셀 코어에 걸쳐 있는 세그먼트를 그리고 보기 영역의 오른쪽에 있는 측정 도구 모음에서 그려진 세그먼트의 길이를 관찰합니다.
셀을 자동으로 감지하려면 3D 보기로 돌아가서 개체 도구 모음에서 별점 아이콘을 클릭하여 개체 목록에 새 별점 개체를 추가하고 자동 별점 생성 마법사를 엽니다. 마법사의 첫 번째 단계에서 관심 영역만 분할하는 옵션을 선택합니다. 그런 다음 Track Spots Over Time 옵션을 활성화하여 추적 데이터를 계산하고 Object-Object Statistics를 활성화하여 스폿 간 비교를 허용하고 데이터 범위를 확장할 수 있습니다.
마법사 창의 오른쪽 아래에 있는 다음 단추를 클릭합니다. 배아의 시신경 tectum을 둘러싸는 관심 영역(region of interest) 또는 ROI 영역(ROI area)을 지정합니다. 각 면에 있는 작은 흰색 화살표를 클릭하고 끌어 ROI의 크기를 수정합니다.
그런 다음 시간 간격 조정을 통해 기록된 모든 프레임으로 확장합니다. 그런 다음 소스 채널을 선택하고 이전에 얻은 셀 지름 측정값을 추정된 XY 지름으로 설정합니다. Background Subtraction(배경 빼기) 옵션을 활성화하고 Next(다음)를 클릭합니다.
intensity threshold 값을 lower 및 upper threshold 상자에 직접 입력하여 모든 세포를 감지할 수 있도록 합니다. 보기 영역을 클릭하면 이러한 모든 변경 사항을 실시간으로 관찰할 수 있습니다. 만족스러우면 Next(다음)를 클릭하여 선택한 품질 임계값을 검증하고 View Area(보기 영역)를 클릭하여 소스 채널에 겹쳐진 이 두 매개변수를 충족하는 지점을 시각화합니다.
그런 다음 Autoaggressive Motion을 추적 알고리즘으로 선택하여 더 많거나 적은 연속 모션이 있는 셀을 추적합니다. 두 프레임 사이에 있는 점의 움직임을 관찰하여 두 시점 사이에서 셀이 이동하는 가장 긴 거리를 판단하고 최대 거리 필드에 예상 숫자를 입력합니다. 최대 간격 크기를 설정하려면 프레임 사이의 간격이 60초 미만인 경우 3 크기를 사용하고 더 긴 시간 간격의 경우 동일한 크기를 늘립니다.
감지된 모든 개체로 갭을 채울 수 있도록 하여 감지 임계값을 떨어뜨리고 트랙을 연결합니다. 그런 다음 다음을 클릭하고 소프트웨어가 이전에 생성 된 모든 지점에 대한 트랙을 자동으로 생성하도록합니다. 가져온 트랙이 많거나 조각난 경우 이전 버튼을 사용하여 생성 마법사로 돌아가서 이전에 정의한 최대 거리를 조정합니다.
3분에서 8분 미만인 추적을 제외하려면 추적 기간 필터의 하한에 대한 데이터 필드에 직접 값을 입력합니다. 다음을 클릭하여 필터의 유효성을 검사하고 생성 마법사로 이동합니다. 피부 대식세포에서 생성된 트랙을 분석에서 수동으로 제거하여 뇌 실질 미세아교세포에 초점을 맞춥니다.
Track Editor를 사용하여 트랙의 다른 잠재적인 실수를 수동으로 수정합니다. 보기 영역의 오른쪽에서 원 선택 모드 버튼을 활성화하고 수정 또는 조정이 필요한 트랙을 강조 표시합니다. 문제가 있는 트랙이 선택되면 Connect 및 Disconnect(연결 끊기) 버튼을 사용하여 셀 이동을 올바르게 나타내도록 편집합니다.
Track Editor에서 Circle Select Mode(서클 선택 모드)를 선택하여 중복된 단일 스폿을 삭제합니다. 형광 표지된 다른 실질 세포와 함께 microglia reporter를 사용하는 경우 추정된 XY 직경과 새 세포 집단까지의 최대 거리를 조정하십시오. 이미지에 대한 소스 채널 입력을 수정합니다.
마지막으로 통계 탭을 사용하여 원하는 추적 통계를 추출합니다. Settings 버튼을 클릭하고 이전에 만든 각 spot object 또는 surface object의 계산에 대한 통계를 선택합니다. 배아 제브라피시의 뇌를 전체적으로 이미지화하고 미세아교세포에 대한 뉴런의 위치를 시각화했습니다.
이 프로토콜을 사용하여 얻은 공간 데이터는 미세아교세포의 평균 속도, 1시간 동안 이동하는 평균 거리, 평균 제곱 변위 및 다른 시간에 공간에서의 분포를 나타냅니다.
