Single-Platelet Fluorescence Imaging에 의한 DHE를 사용한 과산화물 음이온 검출

먼저 변형된 Tyrode의 버퍼에 적절한 코팅 용액을 준비하고 섭씨 37도에서 2시간 동안 배양하여 8웰 마이크로슬라이드를 코팅합니다. 그런 다음 코팅된 마이크로슬라이드를 변형된 Tyrode의 버퍼로 두 번 세척합니다. 비특이적 접착력을 소멸시키기 위해 밀리리터당 5mg의 BSA를 함유한 변형된 Tyrode의 완충액에 마이크로슬라이드를 최소 30분 동안 배양합니다.

세척된 혈소판을 준비하기 위해 구연산 원심분리기를 200G에서 항응고된 전혈을 20분 동안 사용하여 혈소판이 풍부한 혈장을 얻었습니다. 그런 다음 인도메타신과 PGE1을 혈소판이 풍부한 혈장에 넣고 500G에서 10분 동안 원심분리합니다. 생성된 혈소판 펠릿을 섭씨 37도에서 변형된 Tyrode의 HEPES 완충액에 재현탁시켜 밀리리터당 7개의 혈소판의 4배 10의 밀도를 달성합니다.

분리된 혈소판을 섭씨 37도에서 30분 동안 휴지시킵니다. 다음으로, 혈소판 현탁액에 DHE 용액을 첨가하여 최종 농도 10마이크로몰을 달성하고 섭씨 37도에서 1분 동안 배양합니다. 배양 후 마이크로슬라이드에서 차단 용액을 제거하고 이미징을 위해 현미경 스테이지에 놓습니다.

그런 다음 혈소판을 부드럽게 분배합니다. 도립 컨포칼 현미경에서 40X 오일 이멀젼 렌즈를 사용하여 DHE가 2-하이드록시티듐으로 전환되는 것을 모니터링합니다. 10분 동안 이미지를 생성하고 10초마다 이미지를 수집합니다.

작용제에 대한 반응으로 과산화물 음이온 생성을 모니터링하려면 혈소판을 분주한 후 10분 후에 용해성 작용제를 추가하고 추가로 10분 동안 형광 이미지를 수집합니다. 이 프로토콜을 사용하여 혈소판이 콜라겐 또는 피브리노겐에 접착하는 동안 그리고 트롬빈으로 자극된 PLL에 부착된 혈소판에서 과산화물 라디칼의 생성을 연구했습니다.