먼저, 제브라피시의 절제된 난소를 2밀리리터의 세포 해리 용액이 들어 있는 6웰 플레이트에 옮깁니다. 난소를 섭씨 28.5도에서 2-3시간 동안 배양합니다. 2-3 밀리리터의 미리 데워진 L15 배지를 완충액에 첨가하여 분해를 중지합니다.
다음으로, 70마이크로미터 세포 여과기를 6웰 플레이트의 다른 웰에 넣습니다. L15 매체를 웰에 추가하여 매체 수준이 여과기보다 높도록 합니다. 이제 피펫을 사용하여 세포 여과기를 통해 소화 배지를 끌어들입니다.
피펫으로 여분의 매체를 제거하십시오. 4ml의 신선한 L15 배지를 웰에 넣고 난모세포를 부드럽게 부유시킵니다. 몇 분 후 상층액을 피펫팅하여 빼냅니다.
품질 관리를 위해 난모세포를 선택하려면, 신선한 L15 배지가 들어있는 35mm 너비의 접시에 난모세포를 옮깁니다. 광학 현미경으로 10X 이상의 배율로 난모세포를 관찰합니다. 뭉툭한 주사 도구를 사용하여 세포 조각, 1기 난모세포 또는 기타 모든 병기 난모세포를 제거합니다.
성장 단계를 확인하기 위해 난모세포가 포함된 L15 배지에 Hoechst 33342를 첨가하고 배양합니다. UV 레이저 여기 하에서 형광 현미경으로 난모세포를 관찰합니다. 원하는 기준을 충족하지 않는 난모세포를 바늘로 조심스럽게 골라냅니다.
청소년 난소는 투명한 1기 난모세포가 풍부하고 2단계 난모세포의 개체군이 더 적었습니다. 다 자란 물고기의 난소는 불투명한 2-3기 말기 난모세포가 우세한 것으로 나타났다. 참조 방법을 통해 난모세포 표면에 수많은 염색된 과립 세포핵이 생성되어 난모세포를 조밀하게 둘러싸고 있습니다.
대조적으로, 수정된 방법은 과립자 세포핵 염색이 없는 1기 난모세포를 분리할 수 있었습니다.
