시작하려면 24시간 굶주린 Monochamus alternatus와 Tribolium castaneum 딱정벌레의 표면을 표백제, 에탄올 및 증류수로 살균합니다. 곰팡이 감염을 유도하려면 먼저 소나무 나뭇 가지나 밀기울을 원추형 현탁액에 10초 동안 담그십시오. 그런 다음 딱정벌레를 원추형 현탁액에 담그십시오.
건조 후 딱정벌레 한 마리와 나뭇 가지 한 개를 멸균 된 50 밀리리터 튜브에 넣으십시오. 섭씨 25도의 가습되지 않은 인큐베이터에서 딱정벌레를 사육합니다. 배양 후 죽은 딱정벌레를 새 50밀리리터 튜브에 옮기고 튜브 안에 멸균되고 축축한 면 조각을 넣습니다.
곰팡이 감염이 있는 감염된 딱정벌레의 몸을 더듬이, 머리, 흉부, 복부, 날개, 다리와 같은 위치로 해부합니다. 성숙한 곰팡이 식민지의 5mm 디스크 플러그를 자릅니다. 감염된 딱정벌레 조직을 섭씨 4도에서 미리 냉각된 2.5% 글루타르알데히드에 이틀 동안 넣습니다.
다음으로, 0.1% 인산염 완충액에서 5분 동안 샘플을 3회 세척하고 각각 10분 동안 증가된 에탄올 농도로 탈수합니다. 진공 동결 건조기에서 샘플을 건조시킨 다음 주사 전자 현미경으로 곰팡이 구조를 관찰합니다. 밀기울을 원추형 현탁액으로 10초 동안 처리하고 건조 후 페트리 접시에 옮깁니다.
T.castaneum 딱정벌레를 원추형 현탁액에 10초 동안 담근 후 밀기울이 들어있는 페트리 접시에 넣습니다. 부화 후 접시에서 죽은 딱정벌레를 세십시오. 진균 게놈 DNA 분리 키트를 사용하여 기생충 곤충병원성 진균의 유전체 DNA를 추출합니다.
주어진 프라이머 세트를 사용하여 유전자 특이적 증폭을 위한 PCR 반응 혼합물을 준비합니다. 염기서열분석 후 ClustalX 2를 사용하여 뉴클레오티드 염기서열을 정렬합니다. 마지막으로, 최대우도법에 기반하여 MEGA 6을 사용하여 계통발생학적 분석을 수행합니다.
Aspergillus austwickii, Akanthomyces attenuatus, Scopulariopsis alboflavescens와 같은 기생충 곰팡이는 M.alternatus에서 심각한 감염 증상을 일으켰습니다. SEM 관찰은 딱정벌레 표면에 있는 이러한 기생 균류의 형태학적 특성을 더욱 뒷받침했습니다. 곤충병원성 활성은 대조군에 비해 기생균에서 유의하게 높은 사망률을 보였다.
다중 유전자 계통 발생 나무는 세 가지 기생 곰팡이 종과 각각의 속 내의 다른 종 사이의 유전적 거리를 보여주었습니다.
