시작하려면 이미징을 위한 형광 현미경을 설정합니다. 면역 염색 조직 절편이 있는 완전히 염색된 슬라이드를 삽입합니다. 목표가 설정되면 라이브 버튼을 누르고 샘플에 초점을 맞춥니다.
자동 크기 조정 아이콘을 사용하여 채널이 신호로 적절하게 포화되어 있는지 평가합니다. 현미경 설정을 완료한 후 단일 색상 제어 슬라이드로 현미경을 로드합니다. 샘플 아래에 초점을 맞추고 Z-Stack 메뉴에서 시작 옵션을 눌러 Z-Stack 설정을 시작합니다.
그런 다음 샘플 위에 초점을 맞추고 end 옵션을 누릅니다. 이미지의 형광 보정을 위해 단일 control 이미지 중 하나를 엽니다. 부적절한 채널의 신호에 대한 각 채널의 그레이스케일 창을 관찰합니다.
블리드를 제거하려면 매트릭스에 수동으로 숫자를 입력한 다음 apply를 눌러 적절하게 제거되었는지 테스트합니다. 다음으로, 각 컨트롤의 모든 값을 단일 행렬로 조합합니다. 이 매트릭스를 완전히 염색된 샘플에 적용합니다.
ilastik 소프트웨어를 실행하고 티슈의 tiff 파일을 엽니다. 훈련 탭을 클릭한 다음 페인트 브러시 도구를 사용하여 이미지의 개별 셀을 강조 표시합니다. 내부와 세포막이 포함되도록 세포를 강조 표시해야 합니다.
다음으로, 레이블 2를 사용하여 관심 있는 셀이 아닌 모든 항목을 강조 표시합니다. 이제 소프트웨어 3을 실행하고 모든 형광 염색이 포함된 조직의 IMS 이미지를 엽니다. 핵 검출을 위한 소스 채널로 mask over nuclei 옵션을 선택합니다.
그런 다음 시드 포인트로 핵을 분할하기 위한 고급 옵션을 선택합니다. 핵 지름의 값을 설정합니다. 이미지에서 여러 셀이 융합되었거나 셀이 누락되었는지 검사합니다.
그런 다음 생성된 셀 개체를 클릭한 다음 생성 탭을 클릭한 다음 배치를 위한 매개 변수 저장 옵션을 클릭하여 사용 설정을 저장합니다. Anaconda를 시작한 다음 Anaconda 내에서 JupyterLab을 시작합니다. 추가 코딩 파일 1을 연 다음 실행 메뉴에서 모든 셀 실행 또는 선택한 셀 실행을 누릅니다.
프롬프트가 나타나면 내보낸 형광 값에 대한 파일 디렉토리를 입력합니다. 그런 다음 처리된 파일을 저장하기에 적합한 위치에 대한 파일 디렉토리를 입력합니다. 코드의 다음 섹션을 실행하여 각 채널의 이름으로 데이터에 주석을 추가합니다.
게이팅 전략이 설정되면 메뉴에서 population을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 export를 선택합니다. 매개 변수를 헤더가 포함된 csv 파일로 내보냅니다. Anaconda에서 JupyterLab을 다시 시작합니다.
그런 다음 보충 코딩 파일 2에서 스크립트를 열고 코드를 실행합니다. 파일의 소프트웨어 위치를 입력하라는 메시지가 표시되면 내보낸 csv 파일의 파일 디렉토리를 입력합니다. 그런 다음 출력 위치를 추가하라는 메시지가 표시되면 원하는 파일 디렉터리를 선택하고 파일 디렉터리의 끝에 파일 이름이 포함되어 있는지 확인합니다.
코드의 나머지 부분을 실행합니다. 이제 txt 파일의 텍스트를 복사하고 소프트웨어 3에서 해당 ims 파일을 엽니다. 파일에서 셀 개체를 클릭합니다.
통계 탭으로 전환한 다음 텍스트를 검색 창에 붙여넣고 검색을 시작합니다. 이제 관심 있는 모든 셀이 강조 표시됩니다. 스펙트럼으로 겹치는 형광 염료는 여러 염료로 염색된 조직에서 효과적으로 분리되었습니다.
염료의 분리는 림프 조직의 다양한 세포 유형을 명확하게 구별했습니다. 사용자 정의 기계 학습은 서로 밀접하게 압축된 경우에도 세포를 분리하는 데 사용되었습니다.
