시작하려면 100mm 페트리 접시에 10ml의 완전 성장 배지에 6MCA205 섬유육종 세포의 거듭제곱으로 3 곱하기 10을 플레이트합니다. 세포에 자외선을 조사하고 섭씨 37도에서 이산화탄소 5%로 6시간 이상 배양하여 죽게 합니다. 체외 분화 수지상 세포(DC)를 1100G에서 완전한 성장 배지에서 4분 동안 2회 세척합니다.
Trypan blue 염료 배제 테스트를 사용하여 골수 유래 빈 DC를 계산합니다. 방사선 조사된 암세포를 1100G에서 5분 동안 원심분리합니다. 방사선 조사된 자가사멸 세포와 빈 DC의 공동 배양을 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에서 24시간 동안 12웰 플레이트에서 2:1 비율로 설정합니다.
다음 날, 15 밀리리터 튜브에 담긴 10 밀리리터의 완전 성장 배지에서 1100G에서 5 분 동안 세포를 두 번 세척합니다. 세포 표면 염색의 경우 골수 유래 DC를 20마이크로리터의 차가운 FACS 완충액에 다시 현탁시키고 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 20분 동안 배양합니다. FACS 완충액으로 세포를 세척한 후 활력 고정 가능한 근적외선 염료가 포함된 PBS 100마이크로리터를 30분 동안 첨가합니다.
FACS 버퍼에 셀을 다시 현탁하기 전에 PBS로 셀을 한 번 세척합니다. FSCA 및 SSCA 특성을 기반으로 관심 세포를 식별합니다. 그런 다음 FSCA와 FSCH를 플로팅하여 세포 이중선과 덩어리를 분석에서 제외합니다.
780 - 60 나노미터 방출 대역 통과 필터 영역과 SSCA를 플롯하여 죽은 세포를 제거합니다. 575 - 26 및 530 - 30 나노미터 방출 대역 통과 필터를 사용하여 두 개의 파라미터 밀도 플롯에서 CD11C 마커 및 PKH67 형광 세포 링커에 대한 세포 양성을 검출합니다. 계수 후 세포사멸 MCA205 세포를 흡수한 골수 유래 DC로 CD8 T 세포를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소 5%의 비율로 72시간 동안 배양합니다.
EdU를 10 마이크로몰 최종 농도의 공동 배양 배지에 첨가하고 16-20시간 동안 배양합니다. CD8 크로스 프라임을 1100G에서 5분 동안 두 번 원심분리하고 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 20분 동안 차가운 FACS 완충액에서 표면 마커를 염색합니다. FACS 완충액에서 세포를 두 번 세척한 후 활력 고정 가능한 아쿠아 염료를 함유한 100마이크로리터의 PBS에 30분 동안 다시 현탁시킵니다.
플로우 튜브의 PBS에 있는 1% BSA 3mL로 셀 현탁액을 한 번 세척합니다. 세포 고정을 위해 100마이크로리터의 4% 파라포름알데히드를 15분 동안 첨가합니다. 100 마이크로리터의 사포닌 기반 투과화에 세포를 배양하고 시약을 15분 동안 세척합니다.
반응 칵테일 500 마이크로리터를 넣고 어두운 곳에서 30분 동안 배양합니다. 세척 후 100 마이크로 리터의 사포닌 기반 투과 및 세척 시약에 세포를 다시 현탁시킵니다. FSEA 및 SSEA 속성을 기반으로 관심 세포를 식별합니다.
그런 다음 FSEA와 FSEH를 플로팅하여 셀 이중선과 덩어리를 분석에서 제외합니다. 525 - 50 나노미터 방출 대역 통과 필터 영역과 SSCA를 플로팅하여 죽은 세포를 제거합니다. 530 - 30 및 575 - 26 나노미터 방출 대역 통과 필터 밀도 플롯을 사용하여 CD8a 및 CD3에 대한 세포의 양성을 감지합니다.
660 - 620 나노미터 대역 통과 방출 필터를 사용하여 단일 파라미터 히스토그램에서 Alexa Fluor 647 EdU 통합에 대한 세포를 분석합니다. CD11c 양성 수지상세포는 섭씨 37도에서 세포사멸 MCA205 암세포를 효과적으로 집어삼켰으며, 이는 초기 암 면역 주기 단계에서 온도 의존적 식세포작용(temperature-dependent phagocytosis)을 입증했습니다. 식세포작용 후, 수지상세포는 PDL1 수치 감소와 함께 CD86 및 MHC-II 수치가 증가한 것으로 나타났습니다.
성숙한 수지상 세포에 의해 활성화된 CD8 양성 T 세포의 클론 확장은 약 20%의 증식률로 분명했습니다. 종양-온-칩(tumor-on-chip) 모델을 사용하여, 암세포가 방출된 알람인에 대한 이들 T 세포의 화학주성 반응을 관찰하였다.
