공동 배양에서 CD8 교차 프라이밍을 회수한 후 10ml의 완전 성장 배지에서 1100g에서 10분 동안 원심분리합니다. 100 마이크로리터의 죽은 세포 제거 마이크로비드에 1 x 10을 총 7개 세포의 거듭제곱으로 재현탁시키고 실온에서 15분 동안 배양합니다. 분리 컬럼을 자기 분리기에 놓고 결합 완충액으로 헹굽니다.
셀 현탁액을 분리 컬럼으로 옮기고 플로우 스루(flow-through)를 수집합니다. 컬럼을 세척한 후 통과하는 라벨이 지정되지 않은 세포를 수집하고 이전에 수집된 플로우 스루와 결합합니다. 원심분리기는 완전한 성장 배지에서 5분 동안 1100g에서 교차 프라이밍된 생 CD8을 농축했습니다.
계수 후 12개의 웰 플레이트에서 2:1 비율로 CD8 세포와 신선한 MCA205 세포를 교차 프라이밍하고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소에서 72시간 동안 배양합니다. CD8 effector를 회수하기 전에 monensin과 brefeldin을 암 면역 세포 공동 배양에 6시간 동안 첨가합니다. 그런 다음 CD8 이펙터를 복구하고 1100g에서 5분 동안 두 번 원심분리합니다.
차가운 FACS 완충액에서 준비된 3가지 다른 1차 항체 혼합물에 세포를 재현탁시키고 빛으로부터 보호하면서 섭씨 4도에서 20분 동안 배양합니다. 믹스 C의 세포구개에 100 마이크로리터의 고정 용액을 추가하고 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 20분 동안 배양합니다. 세포를 냉수 완충액에 재현탁시키고 섭씨 4도에서 30분 동안 배양합니다.
FACS 완충액에서 세포를 두 번 세척한 후 Vitality Fixable Aqua Dye가 포함된 PBS 100마이크로리터를 세포 펠릿에 30분 동안 첨가합니다. FSCA 및 SSCA 속성을 기반으로 관심 세포를 식별합니다. 그런 다음 FSCA와 FSCH를 플로팅하여 세포 이중선과 덩어리를 분석에서 제외합니다.
525/50 나노미터 방출 대역 통과 필터 및 SSCA를 플로팅하여 죽은 세포를 제거하고, 660/20 및 780/60 나노미터 방출 대역 통과 필터를 사용하여 두 개의 파라미터 밀도 플롯에서 CDAA 및 CD3에 대한 세포 양성을 감지합니다. 또한 CD137 마커에 대한 CD44, CD25 및 CD69 마커와 Mix A, B 및 C에 대한 인터페론 감마 양성 및 그랜자임 B에 대한 세포를 분석합니다. 종양 사멸 분석의 경우 공동 배양 배지에 실시간 세포 사멸 정량 염료를 보충합니다.
라이브 셀 분석 시스템에서 플레이트를 섭씨 37도까지 예열한 후 최대 72시간 동안 2시간마다 데이터 스캔을 수행합니다. 1000g에서 5분 동안 세포를 두 번 원심분리합니다. 20 마이크로리터의 차가운 FACS로 표면 마커용 염색 세포를 완충하고 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 20분 동안 배양합니다.
그런 다음 활력 염료인 프로피듐 요오드화물을 첨가하여 게이팅 전략을 위해 세포를 염색합니다. FSCA 및 SSCA 특성을 기반으로 관심 세포를 식별합니다. 그런 다음 FSCA와 FSCH를 플로팅하여 세포 이중선과 덩어리를 분석에서 제외합니다.
450/50 나노미터 방출 대역 통과 필터를 사용하여 CD45에 대해 음성인 암세포를 검출합니다. 단일 파라미터 히스토그램에서 610/620 나노미터 대역 통과 방출 필터를 사용하여 프로피듐 요오드화물 혼입 세포를 평균 형광 강도로 분석합니다. 다중 파라미터 유세포 분석을 통해 초기 활성화 마커 CD69, 후기 활성화 마커 CD44 및 CD25, CD137 및 CD107의 막 발현, 종양 반응성 마커의 표면 발현 수준이 향상되었습니다.
세포독성 분자, 그랜자임 B 및 인터페론 감마 양성의 세포 내 수준은 점진적으로 유의하게 증가하여 공동 배양 72시간에 발현의 정점에 도달했습니다. 코그네이트 공동 배양된 MCA205 세포는 상당한 수준의 CD8 효과기 매개 사멸을 겪었습니다.
