시작하려면 6개의 선충 성장 매체 또는 NGM 한천 플레이트를 준비합니다. 다음 날, 200 마이크로리터의 대장균 OP50 배양액을 플레이트에 넣고 실온에서 하루 동안 배양합니다. 배양 후 200 마이크로 리터의 0.025 몰 D- 포도당을 4 개의 NGM 한천 플레이트에 넣고 실온에서 건조시킵니다.
Caenorhabditis elegans Bristol N2의 3-4 개의 상이한 덩어리를 유지 보수 NGM 한천 플레이트에서 E.coli OP50으로 장착 된 새로운 NGM 플레이트로 옮깁니다. 예쁜꼬마선충(C.elegans) 벌레를 섭씨 20도에서 습도가 95% 이상인 상태에서 3일 동안 배양합니다. 3 일 후, 접시에 증류수를 넣고 파스퇴르 피펫을 사용하여 벌레를 수집합니다.
수집된 웜을 50밀리리터 원심분리기 튜브로 옮기고 튜브에서 상층액을 제거하기 전에 중력에 의해 침전되도록 합니다. 그런 다음 튜브에 증류수를 추가합니다. 튜브의 부피가 5밀리리터로 줄어들면 표백 용액 10밀리리터를 넣고 약 6분 동안 튜브를 세게 흔듭니다.
그런 다음 튜브에 M9 완충액을 50밀리리터 용량으로 채우고 1400g에서 3분 동안 원심분리합니다. 최대 5밀리리터의 상층액을 제거하고 45밀리리터의 M9 완충액을 튜브에 추가합니다. 마지막 세척 후 상층액을 15밀리리터 표시까지 제거하고 남은 액체를 플레이트에 옮깁니다.
알이 방출되는지 현미경으로 플레이트를 관찰하고 플레이트를 섭씨 20도, 습도 95% 이상에서 14시간 동안 놓습니다. 배양 후 웜을 15 밀리리터 튜브에 모으십시오. 자동 피펫을 사용하여 동기화된 웜 10마이크로리터를 현미경 슬라이드에 추가합니다.
웜의 수를 세고 마이크로 리터 당 500-1000 개의 웜을 얻는 데 필요한 부피를 계산하십시오. 500-1,000마리의 유충 1단계 또는 L1 동기화된 웜을 NGM 한천 플레이트로 옮깁니다. 이전에 E.coli OP50 및 포도당으로 준비하고 파종했습니다.
벌레가 유충 4단계 또는 L4에 도달할 때까지 섭씨 20도에서 접시를 배양합니다. 48시간 후 플레이트에 M9 완충액을 추가하고 파스퇴르 피펫을 사용하여 L4 유충을 수집합니다. 채취한 유충을 1.5밀리리터 튜브에 옮깁니다. 3개의 실험 그룹에 대한 분석 일정을 설계합니다.
각 그룹에서 약 100 마이크로 리터의 웜 현탁액을 400 마이크로 리터의 5 % 루골 요오드 용액을 포함하는 1.5 마이크로 리터 마이크로 튜브로 옮깁니다. 믹서에서 튜브를 5분 동안 부드럽게 저어줍니다. 믹서에서 튜브를 제거한 후 웜이 중력에 의해 침전될 때까지 기다립니다.
M9 완충액 1ml로 웜을 세 번 씻으십시오. 웜을 100 마이크로리터의 M9 완충액에 다시 현탁시킨 후. 약 50 마이크로리터를 슬라이드에 옮깁니다.
커버 슬립을 슬라이드에 놓습니다. 그런 다음 실체 현미경에서 명시야 모드를 선택하고 웜을 관찰합니다. 그룹당 최소 10개의 웜이 포함된 이미지를 jpeg 파일로 저장합니다.
마지막으로, 벌레의 요오드 염색을 기반으로 글리코겐 함량을 계산합니다. 글리코겐 함량 분석의 육안 관찰 결과, 공복 웜은 E.coli OP50을 투여한 웜과 E.coli OP50 및 D-glucose를 투여한 웜에 비해 더 약한 염색을 보였으며 가장 강렬한 염색을 보였습니다.
