스머프 염색을 사용한 예쁜꼬마선충(Caenorhabditis elegans )의 장 투과성 평가

시작하려면 NGM 한천 플레이트에 500 대 1, 000 L1 단계 동기화 Caenorhabditis elegans 웜을 옮기고 시험 당일까지 섭씨 20도에서 배양합니다. 두 개의 실험 그룹에 대한 분석 일정을 설계합니다. M9 완충액을 사용하여 해당 날짜에 L4 웜과 성충 웜을 수집합니다.

수집된 웜을 1.5밀리리터 마이크로 튜브에 옮기고 웜이 중력에 의해 침전될 때까지 기다립니다. M9 완충액 1밀리리터로 웜을 세 번 세척하고 마지막 세척 후 튜브에 약 500마이크로리터를 남깁니다. 자동 피펫을 사용하여 10마이크로리터의 웜 현탁액을 현미경 슬라이드에 추가하고 마이크로리터당 100개의 웜을 얻는 데 필요한 부피를 계산합니다.

새로운 마이크로 튜브에 100 마리의 벌레와 100 마이크로 리터의 25 % 에리오글라우신 디소듐 염 용액에 필요한 부피를 추가합니다. 그런 다음 200마이크로리터의 E.coli OP50 배양액을 추가하고 M9 완충액을 사용하여 부피를 500마이크로리터로 늘립니다. 튜브를 믹서에서 교반하면서 3 시간 동안 배양하여 빛으로부터 보호하십시오.

배양 시 염색 용액이 완전히 제거될 때까지 M9 완충액 1ml로 세척하기 전에 웜이 중력에 의해 침전되도록 합니다. 마지막 세척 후 웜을 250마이크로리터의 M9 버퍼에 다시 현탁시키고 약 50마이크로리터를 슬라이드에 옮깁니다. 커버 슬립을 놓고 슬라이드를 섭씨 20도에서 10분 동안 배양하여 벌레를 마비시킵니다.

실체 현미경을 사용하여 Bright Field 모드에서 총 웜 수와 염색된 총 웜 수를 계산합니다. 장 투과성 분석은 어린 벌레에서 염료 누출을 방지하는 강력한 장 장벽을 보여주었습니다. 대조적으로, 늙은 벌레는 몸 전체에 염료 유출을 나타냈는데, 이는 장막 손상을 나타냅니다.