시작하려면 Hank's Balanced Salt Solution에 10밀리몰 힙 완충액을 보충하여 세척 완충액을 준비합니다. 버퍼를 사용할 때까지 섭씨 4도에서 보관하십시오. DMEM에서 망막 색소 상피 또는 RPE 배지를 준비하고 수조에서 섭씨 37도까지 예열합니다.
안락사된 쥐를 눈이 위를 향하도록 옆으로 평평하게 눕힙니다. 검지 손가락을 눈 위에 놓고 엄지 손가락을 눈 아래에 놓습니다. 눈 주위의 뼈 구조를 부드럽게 눌러 안구가 튀어나오도록 합니다.
약간 열린 가위의 끝을 눈 아래에 삽입하고 눈이 소켓에서 분리될 때까지 손목을 눈에서 90도 부드럽게 회전시킵니다. 즉시 눈을 놓고 70% 에탄올에 5초 동안 굴립니다. 그런 다음 얼음 위에 보관된 세척 완충액으로 눈을 옮깁니다.
해부 현미경으로 세척 완충액과 적신 거즈 조각으로 채워진 페트리 접시에 눈을 놓습니다. 핀셋으로 시신경을 잡고 수술용 칼을 사용하여 Ora Serrata 높이에서 부드럽게 절개하여 눈을 안정시킵니다. Vannas Scissors를 절개 부위에 삽입하고 전방 분절과 유리체가 제거 될 때까지 Ora Serrata 둘레를 자릅니다.
RPE 층을 건드리지 않고 묶인 집게를 사용하여 아이컵에서 망막을 부드럽게 벗겨냅니다. 가위를 사용하여 안구에 구멍을 뚫지 않고 안구에서 시신경과 과도한 결합 조직을 제거합니다. 아이컵을 0.25%트립신 1ml와 0.02%EDTA 1밀리리터가 들어 있는 1.5밀리리터 미세원심분리기 튜브로 옮깁니다.
섭씨 37도의 수조에서 10분 동안 아이컵을 배양합니다. 2분마다 튜브를 제거하고 바닥을 조리대에 40번 단단히 두드립니다. 배양 후 AP-1000 피펫을 사용하여 위아래로 3회 부드럽게 섞어 아이컵을 파괴합니다.
트립신을 중화하려면 아이컵을 제외한 분리된 RPE 시트를 15밀리리터 원뿔형 튜브에 있는 0.5밀리리터의 FBS에 즉시 겹쳐 놓습니다. 그런 다음 FBS 및 RPE 시트 층에 RPE 매체를 추가하여 트립신을 희석합니다. RPE를 340G에서 3분 동안 원심분리합니다.
상층액을 버리고 24웰 플레이트에 적합한 양의 RPE 매체에 셀을 재현탁시킵니다. RPE를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소와 함께 3일 동안 배양합니다. RPE 분리 24시간이 지나면 핵 색소 세포가 완전히 부착되지 않고 가라앉기 시작합니다.
48시간에서 72시간 동안 이 세포는 부착되고 퍼져 나가 투명한 핵에 어두운 색소 침착을 유지합니다. 5일 후, RPE 세포는 육각형 구조를 가진 편광 단층으로 형성되는 세포 대 세포 접촉을 형성하는 데 있어 증가된 공동 유창성을 보여줍니다. 분리된 RPE는 배양 6일 후 RPE 특이적 마커와 긴밀한 접합 무결성에 의해 입증된 바와 같이 순도를 보여주었습니다.
