먼저, 성장 인자 감소 기저막 매트릭스와 오가노이드 배양 배지를 1:2 비율로 포함하는 코팅 용액을 준비합니다. 115웰 플레이트의 각 웰에 코팅 용액 48마이크로리터를 추가하고 플레이트를 섭씨 37도에서 가습 인큐베이터에서 30분 동안 둡니다. 콜라겐 방법의 경우 30mm 내막 삽입물에 콜라겐 젤 1ml를 넣고 가습 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 30분 동안 응고시킵니다.
세포 혼합물을 수확하기 위해 얼음 위에 놓인 세척 매체가 들어있는 10 밀리리터 페트리 접시에서 갓 절제 된 흑색종 조직을 세척하십시오. 멸균 핀셋을 사용하여 종양을 세척 매체가 있는 두 번째 접시로 옮기고 다음 얼음 세척을 위해 세척합니다. 멸균 가위와 칼날을 사용하여 세 번의 헹굼 주기 동안 과도한 결합 조직, 지방 및 잔류 혈액을 제거합니다.
종양을 빈 페트리 접시에 넣고 멸균 칼날로 잘게 다집니다. 그런 다음 다진 조직을 준비된 소화 매체 10ml가 들어있는 50ml의 원추형 튜브로 옮깁니다. 원뿔형을 섭씨 37도의 수조에 넣고 5분마다 소용돌이칩니다.
25분 후 30%FBS가 함유된 ADMEM/F12 배지 10ml를 추가하여 분해를 중지합니다. 다음으로, 70마이크로미터 나일론 세포 스트레이너를 통해 소화된 세포 현탁액을 여과하고 보충된 ADMEM/F12로 여과기를 헹굽니다. 피펫을 사용하여 필터 바닥에 남아 있는 매체를 회수합니다.
그런 다음 섭씨 4도에서 7분 동안 300 x g으로 세포를 펠릿합니다. 상층액을 버린 후 펠릿을 오가노이드 배양 배지에 재현탁시킵니다. 경작을 위해, 씨를 뿌리십시오 200, 오가노이드 배양 매체의 200 마이크로리터로 보충된 전 전쟁 matrigel 입히는 우물에 있는 000개의 세포.
또는 6웰 플레이트에 놓인 사전 응고된 콜라겐 겔 멤브레인 인서트에 1밀리리터의 콜라겐 겔과 혼합된 100만 개의 세포를 파종하고 오가노이드 배양 배지를 웰에 추가합니다. 150-200 마이크로미터 오가노이드를 통과시키기 위해 15 밀리리터 원뿔형으로 옮기고 Dulbecco의 PBS로 세척합니다. 혼합물을 300 x g에서 섭씨 4도에서 7분 동안 원심분리합니다.
상층액을 제거한 후 트립신 대용품으로 오가노이드를 배양하고 3분마다 혼합합니다. 소화를 멈추려면 10% FBS를 함유한 환원 혈청 배지와 함께 ADMEM/F12를 추가하십시오. 혼합물을 300 x g에서 7분 동안 원심분리하고 구개를 오가노이드 배양 배지에 재현탁시킵니다.
마지막으로, 배양을 위해 동일한 초기 파종 밀도로 단일 세포 현탁액을 새로운 matrigel 또는 콜라겐 코팅된 웰에 파종합니다. 2일째와 7일째 마트리겔에서 관찰된 오가노이드의 현미경 이미지는 오가노이드의 크기가 점차 증가했음을 나타냅니다. 또한, 모종양과 마트리겔 또는 콜라겐에서 배양된 각각의 오가노이드 간에 알파-베타-T-세포 비율에서 통계적으로 유의한 차이는 없었다.
