Primary Mouse CD4⁺ T 세포의 로딩 및 Local Ca²⁺ Imaging을 위한 항체를 가진 Protein G Magnetic Beads 코팅

먼저 마우스 림프절과 비장에서 분리한 CD4 양성 T 세포를 채취합니다. 300g에서 5분 동안 2-500만 개의 세포를 원심분리합니다. 상층액을 버리고 10마이크로몰 Fluo-4 AM 및 20마이크로몰 Fura Red AM을 함유하는 480마이크로리터의 T 세포 배지에 펠릿을 재현탁시킵니다. Falcon 튜브를 알루미늄 호일로 덮고 어두운 곳에서 실온에서 20분 동안 세포를 배양합니다.

그런 다음 2ml의 T 세포 배지를 세포에 추가하고 추가로 30분 동안 배양을 계속합니다. Protein G 마그네틱 비드 현탁액을 부드럽게 혼합하고 12.5 마이크로리터를 새 튜브에 옮깁니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 올려 비드가 자석으로 이동할 수 있도록 합니다.

자석의 반대쪽에서 저장 버퍼를 부드럽게 피펫팅하여 제거합니다. 남아 있는 스토리지 버퍼를 제거하려면 500마이크로리터의 PBST와 와류를 10초 동안 추가합니다. 튜브를 마그네틱 스탠드에 다시 놓고 버퍼를 제거합니다.

비드를 항체로 코팅하려면 7.5 마이크로 리터의 PBST에 재현탁시키고 항 CD3 및 항 CD28 각각 5 마이크로 리터를 첨가하십시오. 실온에서 연속 혼합하면서 30-60분 동안 배양합니다. 마그네틱 스탠드를 사용하여 500 마이크로 리터의 칼슘 버퍼로 세척 한 다음 500 마이크로 리터의 칼슘 버퍼로 코팅 된 비드를 세 번 세척 한 다음 200-400 마이크로 리터의 칼슘 버퍼에 비드를 재현탁시킵니다.