먼저, 1% 페니실린과 스트렙토마이신을 함유한 인간 MSC 배지가 있는 6웰 플레이트에서 MSC를 배양합니다. 그런 다음 세포질막에서 세포 추적 보라색으로 ARPE19 Mito-RFP 세포에 라벨링을 진행합니다. 이렇게하려면 20 마이크로 리터의 디메틸 설폭사이드를 세포 추적 보라색 시약 바이알에 넣고 사용 직전에 잘 혼합하십시오.
ARPE19 Mito-RFP 세포를 원하는 밀도인 80 - 90%로 성장시키십시오.로딩 용액을 준비하기 위해 세포 추적 보라색 스톡 용액을 미리 따뜻해진 DPBS에 희석합니다. 그런 다음 세포에서 배양 배지를 제거하고 1mL의 로딩 용액으로 교체합니다. 섭씨 37도에서 10분 동안 세포를 배양합니다.
배양이 끝나면 로딩 용액을 제거합니다. DPBS로 세포를 두 번 세척한 후 신선하고 완전한 배지 2ml를 추가합니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 최소 10분 동안 세포를 배양하여 세포 추적 보라색이 아세테이트 가수분해를 거치도록 합니다.
다음으로, 각 웰에 24마이크로리터의 DPBS를 추가하여 50웰 플레이트를 준비합니다. 커버 유리를 플레이트에 삽입하고 1분 동안 가라앉힙니다. 덮개 슬라이드가 접시 바닥에 가깝도록 음압을 사용하여 웰에서 DPBS를 제거합니다.
세포 밀도가 80-90%에 도달하면 원래 배지를 제거하고 DPBS로 세포를 한 번 세척하고 트립신 EDTA DPBS 혼합물 1밀리리터를 첨가하고 섭씨 37도에서 3-4분 동안 배양합니다. 그런 다음 6개의 웰 플레이트를 가볍게 두드려 부착된 세포를 분리합니다. 소화를 끝내기 위해 신선하고 완전한 배지 1 밀리리터를 추가하십시오.
그런 다음 피펫 건으로 모든 세포를 부드럽게 재현탁시키고 수집된 모든 세포를 15밀리리터 원심분리기 튜브에 옮깁니다. 이제 200G에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다. 상층액을 흡인하고 세포를 1밀리리터의 신선한 배지에 재현탁시킵니다.
계수를 위해 10마이크로리터의 세포 현탁액을 계수 플레이트에 놓습니다. 24웰 플레이트에 MSC 및 ARPE19 세포를 파종한 후 현미경으로 세포를 관찰합니다. 세포가 고르게 분포될 때까지 접시를 흔듭니다.
24시간 동안 배양액에서 배양합니다. 간접 공동 배양을 위해, 24 웰 플레이트의 웰 당 매체의 500 마이크로리터에 있는 10, 000 ARPE19 세포를 참조하십시오. 세포가 파종된 웰에 삽입물을 놓습니다.
씨를 뿌리십시오 10, 우물 당 위 세포 약실에 있는 매체의 100개 microliters에 있는 000의 중간엽 줄기 세포.
