시작하려면 새로 준비된 팽창 매체, 여과된 멸균된 단백질 분해효소 및 항생제 용액, 멸균된 수술 기구를 생물 안전 캐비닛의 작업 플랫폼에 배치합니다. 쥐 꼬리 콜라겐을 100mm 배양 접시와 24mm 트랜스 웰에 첨가하십시오. 살균을 위해 접시를 자외선 아래에서 밤새 열어 두십시오.
살균을 위해 안락사된 쥐를 75% 에탄올에 담그십시오. 코와 입을 담그지 마십시오. 수술용 가위와 집게를 사용하여 아래턱에서 쥐의 복강까지 표피를 자르고 엽니다.
다른 수술용 가위와 집게를 사용하여 양쪽의 갑상선을 찢고 기관, 주변 근육 조직 및 식도 사이의 연결을 제거합니다. 그런 다음 가슴을 조심스럽게 자르고 집게를 사용하여 흉강 깊숙이 파고듭니다. 폐 전체를 제거하고 기관의 끝을 찾으십시오.
갑상선 연골에서 기관지 분지까지의 기관을 잘라내고 4가지 항생제가 함유된 저온 팽창 배지에 넣습니다. 튜브를 흔들어 기관 표면에서 가능한 한 많은 피를 헹구고 얼음 위에 놓습니다. 이제 기관을 4가지 항생제가 포함된 프리콜드 PBS로 옮깁니다.
수술용 가위와 집게를 사용하여 기관 표면에서 혈전 및 기타 조직을 제거하고 1제곱센티미터 크기로 자릅니다. 섭씨 37도의 proteinase 용액에서 기관 조직을 배양합니다. 40분 후 튜브를 여러 번 흔들고 40미크론 세포 여과기를 사용하여 나머지 조직을 제거합니다.
다진 기관을 5 밀리리터의 팽창 매체로 여과기에 헹굽니다. 기관 현탁액을 섭씨 4도에서 5분 동안 400G에서 원심분리하고, 펠릿을 8밀리리터의 팽창 매체에 재현탁시킵니다. trypan blue와 혈구계를 사용하여 생존 가능한 세포를 계산합니다.
쥐 꼬리 콜라겐으로 사전 코팅된 100mm 접시에 플레이트 P0 세포 현탁액. 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 세포를 배양합니다.
