1차 쥐 기도 상피 세포가 80% 밀도에 도달하면 쥐 꼬리 콜라겐으로 코팅된 유리 슬라이드에 세포를 앉힙니다. 그런 다음 파라포름알데히드를 첨가하여 12시간 동안 세포를 고정합니다. 슬라이드를 PBS로 각각 5분 동안 3회 세척하고 PBS에서 3% 소 혈청 알부민과 0.1% Triton X-100으로 1시간 동안 배양합니다.
항-팬 사이토케라틴 항체를 1에서 500으로 희석하여 슬라이드에 넣고 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 이튿날, 1에서 1, 2 시간 동안 2 시간 동안 1에서 1, 000의 희석에 이차 항체로 배양하기 전에 5 분 동안 PBS 해결책으로 활주를 각각 3 번 세척하십시오. PBS로 슬라이드를 세척한 후 1 대 1, 000의 희석액으로 DAPI를 첨가하고 15분 동안 배양합니다.
PBS로 슬라이드를 5분 동안 한 번 씻습니다. 형광 현미경으로 슬라이드를 관찰하여 발현 패턴을 positive control 및 negative control과 비교합니다. 분리 및 원심분리 후 P2 위상 세포를 적절한 부피의 팽창 매체에 다시 부유시킵니다. 1ml의 셀 현탁액을 Transwell 폴리카보네이트 멤브레인 인서트의 정점 챔버에 피펫팅합니다.
1.5ml의 증식 매체를 Transwell의 기저 구획에 추가합니다. 합류점에 도달할 때까지 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다. 다음 구성 요소를 사용하여 50mL의 완전한 분화 매체를 준비합니다.
12.5mL의 분화 매체를 통해 담배 1개비를 거품을 낸 다음 0.22미크론 붓기 필터를 통해 여과하여 담배 연기 추출물 또는 CSE를 준비합니다. CSE 실험과 배치 간의 표준화를 보장하려면 분광 광도계에서 320나노미터에서 흡광도를 측정합니다. 다음으로, Transwells의 정점 및 기저 챔버에서 팽창 매체를 제거합니다.
적절한 농도의 CSE를 함유한 분화 배지를 추가하여 28일 동안 원발성 쥐 기도 상피 세포를 자극합니다. 배양 중에는 PBS로 일주일에 두 번 정점 챔버를 세척하고 기저 챔버의 배지를 CSE가 포함된 새로 준비된 분화 배지로 교체합니다. 쥐 기도 상피 세포는 28일 만에 공기 액체 계면에서 성공적으로 분화되었습니다.
섬모 세포와 잔 세포의 존재는 각각 섬모 마커, 아세틸화 알파 튜불린 및 잔 세포 마커 뮤신 5AC의 면역형광 분석에 의해 입증되었습니다. 다양한 CSE 농도에서 24시간까지의 세포 생존력은 농도가 6%보다 높을 때 상피 세포가 감소하는 것을 보여주었습니다.장기 자극 하의 세포 활성은 2%4% 및 6%CSE 농도에서 유의한 세포 사멸을 보여주지 않았습니다. 그러나 막관통 저항성과 박리된 세포의 변화가 관찰되었습니다.
또한, 쥐 기도 상피 세포 배양이 CSE에 만성적으로 노출되었을 때 분화된 세포와 섬모 세포의 전반적인 감소가 관찰되었습니다.
