시작하려면 Methylomonas 종 LW13 콜로니가 있는 배양 플레이트를 얻으십시오. 유리관에 담긴 6ml의 질산염 무기염 배지에 콜로니를 접종합니다. 세럼 스토퍼와 알루미늄 압착 씰로 튜브를 밀봉합니다.
주사기를 사용하여 메탄을 추가하여 공기 중 메탄의 부피가 50%인 최종 분위기를 만듭니다. 이 플랑크톤 액체 배양액을 실온에서 분당 200회전으로 탁해질 때까지 흔들면 약 하루가 걸립니다. 액체 배양액을 1:10 비율로 신선한 배지에 넣습니다.
메탄영양생물의 액체 배양을 계속 성장시켜 위상 성장을 기록하고, 약 0.5의 600나노미터에서 광학 밀도에 도달합니다. 주사기를 준비하려면 함께 제공된 플런저를 제거하고 멸균 용기에 넣으십시오. 멸균 폴리테트라플루오로에틸렌 또는 PTFE 필터 팁을 각 주사기에 부착하고 주사기를 팁이 아래를 향하도록 하여 표준 시험관 랙에 넣습니다.
그런 다음 멸균 원추형 튜브에서 세포 1mL를 질산염 무기염 배지 5mL 및 용융 아가로스 4mL와 혼합합니다. 아가로스 혼합물을 8밀리리터 표시까지 주사기에 천천히 붓고 응고시킵니다. 약 15분 후 멸균 20mm 고무 부틸 마개로 주사기 캡을 씌웁니다.
실험실 테이프로 마개를 고정하고 주사기에 라벨을 붙입니다. 다음으로, 대형 60밀리리터 주사기에 100% 메탄을 채우고 멸균 23게이지 바늘에 연결된 PTFE 필터 팁을 부착합니다. 큰 주사기로 아가로스 혼합물이 든 주사기의 고무 마개를 뚫고 두 번째 멸균 바늘을 가스 배출구로 삽입합니다.
대형 주사기의 플런저를 눌러 20ml의 100% 메탄이 헤드 공간을 통해 플러시되도록 합니다. 산소 역류를 방지하기 위해 주사기에 1-2밀리리터의 메탄이 남아 있을 때 배출 바늘을 제거합니다. 주사기를 아가로스 혼합물과 메탄으로 섭씨 18도에서 배양합니다.
아가로스를 압출하려면 PTFE 필터 팁을 멸균 23게이지 바늘로 교체하고 고무 마개를 제공된 주사기 플런저로 교체합니다. 플런저를 천천히 눌러 1ml씩 별도의 멸균 1.5mm 미세 원심분리기 튜브에 분주합니다. 야생형 LW13 균주는 메탄과 산소 농도가 모두 낮은 그래디언트 주사기의 특정 깊이에서 뚜렷한 수평 띠를 형성했습니다.
그래디언트 주사기에 접종된 LW13은 메탄 고갈 및 산소 소비량이 수평 밴드의 깊이에 해당하는 메탄-산소 카운터 구배를 보여주었습니다. LW13의 OAT 결실 돌연변이는 야생형 균주에서 관찰되는 뚜렷한 수평 띠 형성이 없었으며, 이는 이 표현형에서 유전자의 역할을 나타냅니다.
