시작하려면 야생형 또는 돌연변이 methylomona 종인 LW13을 접종한 그래디언트 주사기에서 압출된 아가로스 세그먼트를 얻습니다. 0.75 밀리리터의 0.85 % 염화나트륨을 물에 넣고 압출 된 아가로스 샘플에 첨가하고 볼텍싱으로 균질화합니다. 또한, 900 마이크로리터의 염 용액으로 새로운 마이크로 원심분리기 튜브에서 샘플 1 - 10을 희석합니다.
SYTO 9와 프로피듐 요오드화물 염색제의 일대일 혼합물 3마이크로리터로 샘플을 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 배양합니다. 아가로스의 밀리리터당 세포를 측정하려면 마이크로스피어 카운팅 비드 현탁액을 수조에서 5분 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 유세포 분석 전에 10 마이크로리터의 현탁액을 샘플에 추가합니다.
유세포분석기를 사용하여 시료를 분석합니다. cell-free control 샘플과 접종된 agarose 샘플 간의 side scatter versus forward scattered op plot을 비교하여 배경 agarose 입자를 배제하는 박테리아 이벤트 전압 게이트를 도출합니다. 그래디언트 주사기 내에서 콜로니 형성 단위를 계산하려면 800마이크로리터의 질산염 무기염 배지를 압출된 아가로스 세그먼트에 추가하고 10초 동안 와류를 추가하여 피펫팅을 돕습니다.
각 웰에 96마이크로리터의 질산염 무기염 배지가 있는 멸균 180웰 플레이트를 준비합니다. 20마이크로리터의 희석된 아가로스 샘플을 첫 번째 컬럼의 각 웰에 넣고 혼합합니다. 다중 채널 피펫을 사용하여 웰의 첫 번째 줄부터 시작하여 20마이크로리터의 샘플을 10배로 연속적으로 희석합니다.
라벨: 질산염, 무기염, 오거 또는 선택한 매체를 포함하는 정사각형 격자 플레이트. 멀티채널 피펫을 사용하여 96웰 플레이트의 컬럼에서 5마이크로리터를 오거 플레이트에 놓습니다. 압출된 아가로스 샘플을 사용한 유세포 분석은 LW13의 OAT 결실 돌연변이가 야생형 균주에 비해 세포 성장이 감소했음을 확인했습니다.
돌연변이를 OAT 유전자와 보완하면 세포 수와 띠 형성이 야생형과 유사한 수준으로 복원되었으며, 이는 띠 형성에서 유전자의 특정 역할을 나타냅니다.
