시작하려면 인간 배아 줄기 세포에서 인간 미세아교세포를 얻어 56일째에 수확합니다. 망막 오가노이드 유도를 위해 인간 배아 줄기 세포를 줄기 세포 배지에서 세포 밀도가 80-90%에 도달할 때까지 배양배양 세포에 웰당 1mL dispase를 추가하고 섭씨 37도에서 5분 동안 배양합니다. dispase를 제거한 후 각 웰에 1ml의 매체 D를 추가하십시오.
세포를 작은 조각으로 자릅니다. 10 마이크로리터 피펫을 사용하여 모든 세포 조각과 배지를 1.5 밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브에 부드럽게 모읍니다. 튜브를 200 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
상층액을 제거한 후 200 마이크로 리터의 차가운 매트릭스에 세포를 부드럽게 재현탁시킵니다. 1.5밀리리터 마이크로 원심분리기 튜브를 인큐베이터로 20분 동안 이동합니다. 인큐베이터에서 20분 후에 매트릭스가 응고됩니다.
15ml의 매체 D로 10cm 접시를 준비하고 매체 D로 매트릭스를 다시 현탁하고 페트리 접시를 부드럽게 흔듭니다. 접시를 인큐베이터에 5일 동안 넣습니다. 12 일째에 배지를 3 밀리리터의 dispase로 교체하십시오.
5분 후, 디스파제를 흡인하고 15ml의 배지 E를 추가합니다.12일째에 수확된 미세아교세포를 소화된 망막 오가노이드에 도입합니다. 19일째에 플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 오가노이드를 접시 중앙으로 응집하고 매체 E를 매체 F로 교체합니다.마지막으로 매체 F를 가진 오가노이드를 새 현탁액 접시로 옮깁니다. 30일째까지 미세아교세포와 함께 배양한 망막 오가노이드는 유의미한 GFP 자가형광을 보였으며, 이는 미세아교세포의 존재를 나타냅니다.
공동 배양된 망막 오가노이드는 광수용체 마커 CRX 및 미세아교세포 마커 IBA1에 대한 명확한 면역형광 신호를 보여주었습니다.
