시작하려면 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 수행하여 조직 추출된 DNA의 원하는 영역을 증폭합니다. 염기서열분석 증폭 효소 마스터 믹스, 완충액 및 이중 증류수를 실온으로 가져와 즉시 스핀오프합니다. 염기서열분석을 위해 튜브를 준비한 후 증폭을 위해 미리 설정된 PCR 기기에 PCR 튜브를 놓습니다.
그런 다음 PCR 기기에서 생성물을 제거하고 반응 생성물을 빛으로부터 보호되는 냉장고에 보관합니다. 마그네틱 비드를 철저히 소용돌이치십시오. 10웰 플레이트에 40마이크로리터의 마그네틱 비드와 40마이크로리터의 80% 에탄올을 96마이크로리터 추가하고 플레이트를 필름으로 밀봉합니다.
96웰 플레이트를 와류 셰이커에 10초 동안 올려 비드를 완전히 부유시키고 혼합합니다. 그런 다음 수평 발진기에 고무 밴드로 플레이트를 고정하고 3-5분 동안 최대 설정으로 진동합니다. 그런 다음 PCR 플레이트를 자기 스탠드에 놓고 단단히 눌러졌는지 확인합니다.
정적 흡착을 위해 스탠드를 섭씨 4도에서 3분 동안 유지하십시오. 구슬이 흡착되면 천장 필름을 제거하고 폐액을 붓습니다. 40 % 에탄올 80 마이크로 리터로 비드를 두 번 헹굽니다.
폐액을 부은 후 접시를 흡수성 종이에 놓고 부드럽게 두드려 말리십시오. 자성판이 있는 흡수지를 원심분리기에 넣고 120g에서 잠시 회전시킵니다. 알코올을 제거한 후 접시를 섭씨 60도의 오븐에 3-5분 동안 넣어 구슬을 완전히 건조시킵니다.
다음으로, 접시에 40마이크로리터의 순수한 물을 넣고 필름으로 밀봉합니다. 소용돌이 셰이커에 올려 3-5초 동안 흔든 다음 플레이트를 수평 셰이커에 놓습니다. 그것을 고정하고 플레이트를 3-5분 동안 흔들어 정제된 염기서열분석 산물을 녹입니다.
마지막으로 용해된 염기서열분석 산물을 180g에서 회전시키고 모세관 전기영동을 이용한 게놈 분석에 사용합니다. 이 방법은 업스트림 및 다운스트림 프라이머의 증폭 간격에서 알려진 RHOA G17V 돌연변이 및 기타 저주파 돌연변이를 검출할 수 있습니다. 두 개의 추가 유전자, 즉 IDH2 및 JAK1의 돌연변이도 이 방법을 사용하여 정확하게 분석되었습니다.
