재생 및 약물 효과 연구를 위한 인간 난소 상피 단층 및 오가노이드 개발

시작하려면 냉동 보존된 인간 난소 표면 상피 세포를 해동합니다. 세포를 10mL의 세척 매체와 혼합합니다. 세포를 원심분리한 후 2ml의 난소 표면 상피 또는 OSE 2D 배지에 펠릿을 재현탁시키고 12웰 플레이트의 두 웰로 옮깁니다.

1ml의 추가 OSE 2D 배지를 웰에 넣고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소가 있는 가습 인큐베이터에서 72시간 동안 배양한 후 첫 번째 배지 갱신. Trypan Blue 염색을 사용하여 자동 세포 계수기를 통해 갓 분리하거나 냉동 보존된 동결 해동된 살아있는 인간 난소 표면 상피 세포를 계수합니다. 얼음처럼 차가운 OSE 오가노이드 염기성 배지 1mL에 원하는 수의 세포를 혼합하고 튜브를 240G에서 5분 동안 원심분리합니다.

피펫을 사용하여, 얼음 차가운 희석되지 않는 지하실 막 추출물 해결책에 있는 세포 10, 10 마이크로리터 당 000의 세포를 얻기 위하여 펠릿을 현탁시키십시오. 예열된 다중 웰 챔버 슬라이드에 웰당 10마이크로리터의 OSE 기저막 추출물 용액 방울을 추가하고 이산화탄소 5%가 포함된 가습 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 플레이트를 거꾸로 놓고 15분 동안 가열합니다. 겔이 응고된 후 100마이크로리터의 OSE 3D 배지를 넣고 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소가 있는 가습 인큐베이터에서 배양합니다.

사용한 매체를 제거한 후 각 웰에 100마이크로리터의 얼음처럼 차가운 고급 DMEM F12를 추가합니다. P1000 피펫 팁으로 웰 바닥을 긁어 겔 방울을 분리하고 각 부유 겔 방울을 1.5mL 튜브로 옮깁니다. 240G에서 5분 동안 튜브를 원심분리합니다.

상층액을 버린 후 펠릿을 300 마이크로리터의 세포 해리 완충액에 재현탁시키고 튜브를 섭씨 37도에서 5-10분 동안 예열된 비드 배스에 넣습니다. 다음으로, 300 마이크로리터의 인간 OSE 오가노이드 염기성 배지를 추가하고 240G에서 5분 동안 원심분리합니다. 마지막으로, 원하는 부피의 희석되지 않은 기저막 추출물 용액에 펠릿을 재현탁시켜 배양에 적합한 비율로 다시 파종합니다.

1차 인간 OSE 세포는 3번 통로까지 조약돌과 같은 형태를 보였으나 그 이후에는 노화의 징후를 보였다. 갓 분리한 OSE 세포의 인간 OSE 오가노이드는 배양 14일 후 2D 확장 OSE 세포의 오가노이드보다 더 크게 성장했습니다. 3D OSE 오가노이드에서 낭포성(cystic), 단층(monolayer), 다층(multilayered) 및 비루멘화(non-lumenized) 세포 클러스터를 포함한 다양한 형태가 관찰되었습니다.