CMG 매개 DNA 풀림을 시각화하기 위한 Single Molecule Total Internal Reflection Fluorescence Assay (CMG 매개 DNA 풀기 시각화를 위한 단일 분자 총 내부 반사 형광 분석)

시작하려면 갓 준비한 필터 멸균 차단 완충액, 10X 반응 완충액 1 및 2를 작업 플랫폼에 배치합니다. 2.5ml의 차단 완충액과 5ml의 초순수가 들어 있는 개방형 튜브를 건조기에 넣고 진공 상태에서 가스를 제거합니다. 15분 후 압력을 해제하고 튜브를 제거합니다.

준비된 비오틴-PEG 플로우 셀 어셈블리를 현미경 스테이지에 놓고 양쪽 끝에 접착 퍼티를 사용하여 고정합니다. 바늘을 통해 플로우 셀 출구 튜브를 주사기 펌프에 연결합니다. 대물 히터를 섭씨 30도로 켭니다.

튜브에 담긴 1-2ml의 탈기된 물을 플로우 셀 근처의 별도의 접착 퍼티 조각에 고정합니다. 입구 튜브가 바닥에 닿을 때까지 튜브에 삽입하고 채널을 통해 물을 흘립니다. 유속을 높여 입구 튜브 근처에 갇힌 기포를 제거합니다.

100 마이크로리터의 탈기된 차단 완충액을 스트렙타비딘당 1밀리그램의 20마이크로리터 분취액에 첨가합니다. 열린 튜브를 접착 퍼티에 부착합니다. 물에서 스트렙타비딘으로 입구 튜브를 옮기고 2분 동안 분당 40마이크로리터의 속도로 흐름을 시작합니다.

5분 후 차단 완충액으로 과도한 스트렙타비딘을 씻어냅니다. 25 나노몰 SYTOX 오렌지를 함유하는 차단 완충액에 희석된 비오틴화된 DNA의 흐름. 532 나노미터 레이저로 실시간 뷰를 사용하여 DNA가 표면에 붙어있는 것을 실시간으로 볼 수 있습니다.

표면에서 원하는 DNA 밀도에 도달하면 25 나노몰 SYTOX가 포함된 차단 완충액에 흐르게 하여 유리 DNA를 씻어냅니다. 이제, 25 나노몰 SYTOX 오렌지를 함유하는 차단 완충액에 희석된 유동 및 비오틴화 항-디곡시제닌 항체. 비오틴화 항-디곡시제닌 항체와 차단 완충액이 있는 SYTOX Orange를 세척합니다.

50 마이크로리터의 ATP-감마-S 혼합물을 플로우 셀로 흘립니다. 30 마이크로 리터의 ATP-감마-S 혼합물에서 약 100 나노 몰 최종 농도에 정제 된 CMG 헬리 카제를 첨가하고 20 마이크로 리터에 대해 분당 20 마이크로 리터로 흐릅니다. 15분 동안 배양합니다.

다음으로, 분당 40마이크로리터의 속도로 80마이크로리터의 ATP RPA 혼합물을 흐름시킵니다. 50-100밀리초의 노출로 각 레이저를 사용하여 488 나노미터 레이저로 EGFP RPA를 시각화하고 획득한 다음 640 나노미터 레이저로 CMG를 획득합니다. 마지막으로 532나노미터 레이저로 SYTOX Orange 염색 DNA를 시각화하고 획득합니다.

CMG 헬리카제 DNA 풀림은 시간이 지남에 따라 추적된 노란색 RPA의 선형 성장으로 시각화되었으며, 이는 풀린 DNA 가닥을 나타냅니다. 단일 가닥 DNA 손상은 데이터에서 더 적은 수의 완전한 추적으로 입증된 것처럼 관찰된 성공적인 풀림 이벤트의 수를 감소시켰습니다.