화학 독성 시험을 위한 돼지 각막 장기 배양 및 상피 상처 치유

시작하려면 1리터 비커에 넣은 돼지 눈을 가져 가라. 핀셋으로 안구를 잡고 멸균 페트리 플레이트에서 가위로 여분의 안구 조직을 제거합니다. 상피에 상처를 입히려면 살균된 보푸라기가 없는 물티슈를 사용하여 안구를 잡고 각막 중앙을 6mm 트레핀으로 표시합니다.

그런 다음 작은 메스나 모서리가 무딘 부드러운 면도날을 사용하여 트레핀으로 표시된 원 내의 상피 세포를 부드럽게 긁어냅니다. 기저막이 손상되지 않도록 하면서 모든 세포 파편을 제거합니다. 그 후 면봉으로 상처 부위를 닦아냅니다.

메스와 가위를 사용하여 각막 공막 테두리를 따라 절단하여 안구를 절개합니다. 그런 다음 PBS가 들어 있는 멸균된 500밀리리터 비커에서 각막을 헹굽니다. 다음으로, 절제된 각막을 멸균 틀에 거꾸로 놓습니다.

섭씨 48도에서 유지되는 1% 아가로스를 포함하는 최소 필수 매체(MEM)로 내피 각막강을 채웁니다. 이제 각막을 뒤집어 35mm 접시에 옮깁니다. 검사제의 유무에 관계없이 2ml의 MEM을 중앙 각막 표면에 적하하여 상피가 공기에 노출된 상태에서 가장자리 결막 영역이 덮여 있는지 확인합니다.

그런 다음 배양 접시를 섭씨 37도의 가습된 5% 이산화탄소 인큐베이터에 넣습니다. 상처 후 40시간이 지나면 Richardson 염색액으로 상처 배양 각막을 염색합니다. 사진을 찍기 전에 PBS로 염색된 각막을 씻으십시오.

그런 다음 같은 크기의 트레핀을 사용하여 원래 상처를 표시하고 작은 메스를 사용하여 표시된 원 안의 상피 세포를 긁어냅니다. 수집된 세포를 제거하고 사전 냉각된 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 네파페낙 0.1%로 처리한 각막에서 브롬페낙 0.09% 및 케토롤락 0.45%로 처리한 각막에서 LL-37 처리한 각막이 밀리리터당 0.2 및 0.5마이크로그램으로 치료되지 않은 각막에 비해 고포도당 조건에서 상처 치유가 유의하게 가속화된 것으로 나타났다.