재생 및 온전한 사지 조직에서의 원자력 현미경 측정을 위한 Axolotl Tissue Mounting and Processing

직경 1cm의 1cm 길이의 실린더를 준비하려면 분젠 버너 화염 아래에서 판지 절단기를 가열하고 가열 된 블레이드로 15mm 튜브를 자릅니다. 실린더의 한쪽을 Parafilm 조각으로 덮습니다. 아홀로틀을 마취하고 촉각 자극에 반응하지 않는지 확인한 후 팔다리를 신체 축에 수직으로 향하게 합니다.

zeugopodial 영역의 석회화 된 부위 바로 원위에있는 사지를 절단하십시오. 진통제와 함께 신선한 물이 들어 있는 탱크에 axolotl을 되돌립니다. 24시간 후, 아홀로틀을 신선한 담수로 다시 옮기고 원하는 관심 단계까지 팔다리가 재생되도록 합니다.

마취된 아홀로틀을 실체 현미경 아래에 놓은 후 조직 용해 및 응축 연골 단계를 위해 원하는 재생 단계에서 사지의 길이를 측정합니다. 팔다리를 모은 후 해부를 위해 페트리 접시에 넣으십시오. 실체 현미경으로 팔꿈치 높이에서 메스로 팔다리를 절개하고 APBS 용액이 들어있는 페트리 접시에 넣습니다.

파스퇴르 피펫과 섭씨 37도로 설정된 써모블록을 작업 플랫폼에 아가로스 부분 표본으로 배치합니다. 섭씨 영하 20도의 냉동고에서 콜드 블록을 제거하고 파라필름으로 덮인 끝이 아래를 향하도록 실린더를 그 위에 놓습니다. 팔다리를 깨끗한 접시에 놓고 티슈 페이퍼로 절개한 팔다리에서 과도한 액체를 부드럽게 제거합니다.

녹은 저융점 아가로스를 위에 추가하고 아가로스에서 팔다리를 잠시 움직여 피부 표면에 남아 있는 APBS를 대체합니다. 팔다리를 실린더 내부에 빠르게 배치하여 관심 영역이 위쪽을 향하도록 수직 방향이 되도록 합니다. 조직이 완전히 덮일 때까지 실린더 내부에 낮은 융점 아가로스를 추가합니다.

다음으로, 콜드 블록에서 실린더를 제거하고 아가로스가 30초 동안 응고되도록 합니다. 응고 후 실린더 바닥에서 파라필름을 제거하고 시아노아크릴레이트 접착제로 아가로스 함유 조직을 비브라톰 스테이지에 부착합니다. 그런 다음 메스로 주변의 과도한 아가로스를 제거합니다.

단면을 위해 APBS 솔루션에 스테이지를 담그십시오. 조직 끝에 도달할 때까지 100마이크로미터 단위로 아가로스를 절단하기 시작합니다. 그런 다음 조직의 원위 부분이 제거될 때까지 절개합니다.

면도날을 사용하여 비브라톰 단계에서 조직이 포함된 아가로스 블록을 조심스럽게 제거합니다. 즉시 수술용 조직 접착 접착제를 사용하여 블록을 35mm 플라스틱 페트리 접시에 부착합니다. 조직을 덮기 위해 약 2ml의 배양 배지를 추가합니다.