Axolotl Limb Section의 조직 강성 분석을 위한 원자력 현미경 기반 압흔 측정

원자력 현미경 또는 AFM 측정 전에 캔틸레버를 유리 블록에 장착합니다. PBS로 채워진 페트리 접시를 모터 스테이지의 홀더에 삽입하고 유리 블록을 AFM 헤드에 삽입합니다. 그런 다음 캔틸레버가 버퍼에 잠기도록 AFM 헤드를 페트리 접시 위에 놓고 레이저를 수동으로 정렬합니다.

JPK 소프트웨어에서 접근 및 획득 버튼을 눌러 캔틸레버를 단단한 표면으로 전진시킵니다. 단일 힘-거리 곡선이 획득되면 교정 관리자를 열고 method(방법)에서 contact-based(접촉 기반)를 선택합니다. 그런 다음 실내 온도를 섭씨 20도로 조정합니다.

이제 곡선을 확대하고 감도 맞춤을 위한 선형 부분을 선택합니다. 민감도 확인란을 클릭하고 캔틸레버를 표면에서 200마이크로미터 정도 집어넣습니다. 그런 다음 무한대 기호 확인란을 선택하고 Run Thermal Noise를 클릭합니다.

다음으로, 결과 주파수 그래프를 확대하고 마우스 오른쪽 버튼 클릭 버튼을 사용하여 범위를 정의합니다. 스프링 상수(Spring Constant) 확인란을 선택하고 캘리브레이션 매니저를 닫습니다. 조직 블록과 배양 배지에 내장된 재생된 아홀로틀 팔다리가 포함된 페트리 접시를 AFM의 접시 홀더에 삽입합니다.

bright-field 모드에서 조직 블록의 개요 이미지를 획득합니다. 관심 영역을 확대하고 노출 시간과 초점을 조정합니다. 압입 측정을 위한 그리드 매개변수를 설정하고 힘-거리 곡선 배열을 기록합니다.

PyJibe 소프트웨어에서 데이터를 처리하려면 힘 변위 곡선이 포함된 파일을 엽니다. 전처리 탭을 선택하고 Contact point estimation(접촉점 추정)에서 slicewise fit with line and polynomial(선과 다항식을 사용한 조각별 맞춤)을 선택합니다. 그런 다음 맞춤 탭을 선택하고 모델에서 구형 압자를 선택하고 방법에서 nelder를 선택합니다.

PyJibe 소프트웨어에서 점탄성 분석을 위해 힘 거리 곡선이 포함된 파일을 엽니다. 전처리 탭을 선택하고 Contact point estimation(접촉점 추정)에서 slicewise fit with line and polynomial(선과 다항식을 사용한 조각별 맞춤)을 선택합니다. 그런 다음 맞춤 탭을 선택하고 모델에서 KVM 모델을 사용하여 점탄성을 보정한 Hertz 모델을 선택합니다.

방법에서 leastsq를 선택합니다. 정확한 압자 반경을 10마이크로미터로 설정하고 접근 속도를 초당 7.5마이크로미터로 설정합니다. Apply Model 및 Fit All을 눌러 겉보기 및 완화되지 않은 Young's moduli, 겉보기 점도, Maxwell 요소 완화 시간을 구합니다.

온전한 사지의 요골과 척골에 대한 명백한 영률(Young's modulus) 측정은 유의미한 차이를 보이지 않았다. 조직분해 단계에서 요골과 척골의 겉보기 영률(Young's moduli)은 각각 0.03kg와 0.13kg으로 급격히 감소했습니다. 온전한 연골의 중앙에 있는 겉보기 영률(Young's moduli)은 주변부보다 높았다.

조직용해 단계에서, 명백한 영률(Young's modulus) 측정은 연골 중심과 주변부 사이에 유의미한 차이를 보여주지 않았습니다. 연골 결로 동안, 겉보기 영률(parent's moduli)은 중간 강성 값을 나타내는 0.77 킬로파스칼로 유의하게 증가하였다. unrelaxed moduli는 조직용해 중 온전한 조직과 응축 연골에서 상당한 차이를 보였습니다.

겉보기 Young's moduli는 unrelaxed moduli와 매우 유사했으며, 이는 주로 탄성 반응을 나타냅니다. 겉보기 점도는 온전한 조직 및 응축된 연골에 비해 조직용해 중에 현저히 낮았습니다.