먼저 500 마이크로리터의 protein-free image buffer를 플로우 셀의 채널 3에 추가합니다. 맥주효모균 NAP1 2나노몰과 LD655 표지 H4 히스톤 옥타머 2-5나노몰을 500마이크로리터의 1X HR 완충액과 혼합합니다. 이 혼합물을 플로우 셀의 채널 4에 추가합니다.
모든 채널을 1.0bar에서 30초 동안 흐르게 하여 샘플로 플러시합니다. 유량을 0.2bar로 설정하고 광학 트랩을 채널 1로 이동하여 적합한 스트렙타비딘 코팅 비드 쌍을 포착합니다. 그런 다음 광학 트랩을 채널 3으로 이동합니다.
흐름을 끄고 비드 쌍에 대한 강제 보정을 수행합니다. 빨간색 컨포칼 레이저를 켜고 이미징 영역을 보정합니다. 유량을 0.2bar로 설정한 후 광학 트랩을 채널 2로 이동하여 비오틴화된 DNA를 포착합니다.
그런 다음 옵티컬 트랩을 채널 3으로 이동하고 흐름을 중지합니다. 광학 트랩 사이의 거리를 늘려 DNA를 늘리고 관련 강제 거리 곡선을 모니터링하여 단일 DNA 테더의 존재를 확인합니다. DNA 장력이 약 1피코네톤이 되도록 광학 트랩 사이의 거리를 조정합니다.
라인 스캐닝을 켜서 빨간색 레이저가 켜진 상태에서 카이모그래프 수집을 시작합니다. 그런 다음 광학 트랩을 흐름이 꺼진 채널 4로 이동하여 DNA 테더를 따라 뉴클레오솜을 형성합니다. 뉴클레오솜을 풀려면 광학 트랩을 채널 3으로 이동합니다.
힘 판독값을 0으로 설정하고 속도를 초당 0.1마이크로미터로 설정하고 광학 트랩 1을 광학 트랩 2에서 멀리 이동합니다. 10 나노 몰의 Cy3 표지 링커 히스톤 H1.4를 500 마이크로 리터의 이미지 버퍼에 혼합하고 채널 5에 첨가합니다. 뉴클레오솜을 포함하는 DNA 테더를 형성한 후 적색 레이저 외에 녹색 레이저를 켜고 광학 트랩을 채널 5로 이동하여 크로마틴에 결합하는 H1을 실시간으로 이미징합니다.
DNA 테더를 따른 뉴클레오솜 형성은 2D 스캔 및 카이모그래프에서 고정된 적색 형광 초점으로 시각화되었습니다. 광표백 분석은 단핵구좀의 존재를 나타내는 1단계 또는 2단계 사진 표백 이벤트를 보여주었습니다. NAP1이 없을 때, 히스톤 옥타머는 DNA를 결합시켰지만, 일정한 장력에 의해 나타난 것처럼 대부분 포장되지 않은 상태로 남아 있었다.
Cy3 표지 H2A를 사용하여 LD655 표지 H4와 마찬가지로 유사한 뉴클레오솜 조립 결과를 얻었습니다. 뉴클레오솜 해제는 시간이 지남에 따라 테더 거리를 증가시켰고, 이는 카이모그래프에서 볼 수 있었으며, 개별 뉴클레오솜의 언래핑을 나타내는 특징적인 찢어짐이 있는 강제 거리 곡선을 생성했습니다. 크로마틴에 대한 링커 히스톤 H1 결합은 뉴클레오솜에 대한 H1의 결합을 나타내는 이중 색상 고정 궤적과 확산 H1 궤적을 나타내는 녹색 들쭉날쭉한 궤적을 가진 녹색 형광 병소로 표시되었습니다.
