먼저 양에서 채취한 골연골 추출물을 25ml의 탈수 용액이 들어 있는 40ml의 유리 유리병에 탈수합니다. 바이알을 실온에서 1시간 동안 회전 휠에 놓습니다. 마지막 세척 후 탈수 용액을 25ml의 크실렌으로 교체하십시오.
유리 바이알을 실온에서 1시간 동안 회전 휠에 놓습니다. 다음으로, 10% 과산화벤조일, 10% 디부틸 프탈레이트, 프로판올에 1-20으로 희석한 N, N-디메틸아닐린 450마이크로리터를 넣고 유리 바이알을 섭씨 영하 20도에서 밤새 둡니다. 이제 explant를 플라스틱 상자에 담긴 중간 크기의 임베딩 몰드에 넣습니다.
메틸메타크릴레이트, 벤조일퍼옥사이드, 디부틸 프탈레이트, N, N-아닐린 용액을 금형에 붓습니다. 5분 동안 질소 흐름으로 금형을 환기시킵니다. 상자를 완전히 닫고 MMA 중합 및 경화를 위해 섭씨 4도에서 48시간 동안 둡니다.
2일 후 금형에서 엑스플랜트를 함유한 수지를 제거합니다. 장축을 따라 다이아몬드 톱을 사용하여 외식물을 포함하는 폴리메틸메타크릴레이트 블록을 절단하여 분당 3mm의 속도로 3000RPM에서 1.5mm 두께의 섹션을 생성합니다. 오름차순으로 탄화규소 종이로 단면을 갈아냅니다.
두꺼운 부분을 10나노미터 탄소 필름으로 카본코팅합니다. 알루미늄 스텁에 섹션을 장착합니다. 그런 다음 섹션 상단과 스텁 사이에 은색 페인트 다리를 만들어 전자 전하가 지면으로 배출될 수 있도록 합니다.
스텁을 주사 전자 현미경 또는 SEM 스테이지에 놓습니다. 챔버를 닫고 진공을 시작합니다. 전자빔을 켜고 SEM 설정을 조정하여 후방 산란 전자 모드에서 작동하도록 합니다.
그레이 레벨 표준을 탄소의 경우 25, 알루미늄의 경우 225, 실리콘의 경우 253으로 설정합니다. 표준물질로 SEM을 보정한 후 후방 산란 전자 모드에서 표본의 이미지를 획득합니다. 표본의 후방 산란 전자 이미지를 사용하여 회색 수준을 칼슘 함량으로 변환합니다.
그런 다음, 영상의 칼슘 분포 내용을 플로팅합니다. 섹션을 s에 놓습니다.tage 라만 마이크로분광계의 경우. 정확도를 위해 파수를 보정하고 측정 전에 레이저를 정렬합니다.
라만 스펙트럼을 수집하려면 30밀리와트에서 785나노미터 레이저를 사용하십시오. 적분 시간을 20초로 설정하고 세 번 반복한 다음 350에서 1, 800 센티미터의 스펙트럼 범위를 사용하고 밀리미터당 1, 200 라인의 등급을 사용합니다. 나노인덴테이션 시스템이 보정되면 샘플을 광학 시스템에 놓고 나노인덴테이션 위치를 식별합니다.
그런 다음 샘플을 압흔 장치 아래로 이동합니다. 압흔 깊이를 900나노미터로 설정하고 로딩-언로딩 속도를 분당 40mm로 설정하고 로딩과 언로딩 사이에 15초의 일시 중지를 설정합니다. 뼈 조직의 코사인 계수를 0.3으로 설정하고 나노인덴테이션을 시작합니다.
