시작하려면 식물 조직에서 DNA를 추출하고 DNA 농도를 측정합니다. 0.2밀리리터 원심분리기 튜브에 필요한 모든 성분을 추가한 후 반응을 설정합니다. 뇌관 확대 후에, PCR 제품의 3 마이크로리터 및 5의 2 마이크로리터, 000의 기본적인 쌍 DNA 감적을 agarose 젤의 우물에 적재한다.
전압을 120볼트로, 전류를 400밀리암페어로 설정하고 40분 동안 전기영동을 실행합니다. 다용도 겔 이미지 분석 시스템을 사용하여 겔 결과를 보고 분석할 수 있습니다. 시퀀싱 유닛을 통해 샘플을 실행한 후 Create a New Project(새 프로젝트 만들기)를 선택하고 Okay(확인)를 클릭하여 소프트웨어 홈페이지로 이동합니다.
File(파일) 메뉴에서 Import and Add Samples(샘플 가져오기 및 추가)를 선택합니다. 시퀀스 추적 형식 파일을 선택하고 어셈블되지 않은 샘플에서 처리할 파일로 가져옵니다. Contig를 선택합니다.
그런 다음 Advanced Assembly(고급 어셈블리)로 이동하여 Assemble in Groups(그룹으로 조립)를 선택합니다. 이름을 정의하라는 대화 상자가 나타나면 define sample name parts 섹션에서 파일 이름을 수정하고 Assemble을 클릭하여 정렬된 시퀀스를 표시합니다. Go(이동)를 선택한 다음 Search Sequence(검색 시퀀스)를 선택하고 Okay(확인)를 클릭하여 일치하는 시퀀스를 찾습니다.
Contig를 선택한 다음 Delete를 선택하여 저품질 시퀀스와 함께 5.8S 및 28S 영역을 제거합니다. 일치를 위해 접합된 시퀀스와 함께 출력을 내보냅니다. NCBI의 뉴클레오티드 데이터베이스를 사용하여 BLAST 검색을 선택합니다.
Global Pharmacopoeia Genome Database에 해당하는 종 식별 도구와 특정 프라이머 ITS-2를 선택합니다. NCBI에서 3종의 Angelica와 1종의 Peucedanum praeruptorum의 염기서열을 outgroup으로 다운로드합니다. 얻어진 결과 시퀀스와 함께 이러한 시퀀스를 분석합니다.
그런 다음 파일을 클릭합니다. 파일 또는 세션 열기를 선택하여 파일을 가져오면 대화 상자가 나타납니다. 염기서열 비교를 위해 Align(정렬)을 선택한 다음 DNA를 선택하고 Align by ClustalW를 선택합니다.
계통발생(phylogeny)으로 이동하고 Construct Test Neighbor Joining Tree(테스트 네이버 조인 트리 구성)를 클릭하여 계통발생 트리를 생성합니다. 겔 전기영동 결과는 샘플 AS1, AS2 및 AS3에 대해 약 500개의 염기쌍을 나타냈으며, 음성 대조군에는 밴드가 없어 추출된 DNA의 성공적인 증폭을 나타냅니다. 염기서열분석 결과, BLAST를 사용하여 100% 염기서열 유사성을 가진 Angelica sinensis를 식별했으며, GPGD 데이터베이스의 결과와 일치했습니다.
계통발생학적 분석에서, 스플라이싱 염기서열은 부트스트랩 지지값 100을 가진 Angelica sinensis OR8797150.1로 군집화되어 Angelica sinensis로 식별됨을 증명합니다.
