먼저 돌연변이 및 X134 식물의 씨앗을 수확하고 수분 함량이 약 13-15%에 도달할 때까지 실온에서 자연 건조시킵니다.필링 기계를 작동시킨 후 쌀알 10g을 피더에 넣어 글루메 껍질을 효율적으로 제거합니다. 껍질을 벗긴 쌀씨를 정미기에 옮기고 기계를 60초 동안 작동하여 도정미를 산출하는 알루론층을 제거합니다. 다음으로 정백한 쌀을 티슈 그라인더에 넣습니다.
분쇄 빈도를 60Hz로 조정하고 분쇄기를 15초 동안 두 번 실행하여 쌀가루를 생성합니다. 빻은 쌀가루를 페트리 접시에 담그고 37°C로 12시간 동안 예열된 오븐에 넣습니다. 그런 다음 100mL 미세 원심분리기 튜브에 쌀가루 2mg을 넣고 튜브를 가볍게 두드립니다.
튜브에 정제수 180L를 넣고 샘플을 수조에서 20분 동안 끓입니다. 샘플이 냉각된 후 췌장 알파 아밀라아제가 함유된 AMG 4mL를 튜브에 주입합니다. 다음으로, 와류 발진기에서 내용물을 혼합하고 튜브를 37 °C에서 16 시간 동안 연속 교반으로 배양합니다.
이제 4mL의 에탄올을 넣고 소용돌이를 사용하여 샘플을 혼합합니다. 그런 다음 1, 500G에서 튜브를 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 디캔팅한 후 50% 에탄올 2mL를 첨가한 다음 50% IMS 6mL를 튜브에 넣고 혼합합니다.
튜브를 원심분리한 후 상층액을 조심스럽게 붓고 튜브를 뒤집어 과도한 액체를 배출합니다. 튜브를 얼음 욕조에 넣고 2몰 수산화칼륨 2mL를 넣고 샘플을 20분 동안 저어 플록을 다시 부유시키고 저항성 전분을 용해시킵니다. pH 3.8로 조정된 1.2몰 아세트산나트륨 완충액 8mL를 튜브에 넣고 자석 교반기를 사용하여 혼합합니다.
그런 다음 즉시 0.1mL의 AMG를 혼합물에 넣고 잘 섞습니다. 소용돌이를 사용하여 간헐적으로 혼합하는 수조에서 50C에서 30분 동안 샘플을 배양합니다. 배양 후에, 1, 10 분 동안 500 G에 관을 분리하십시오.
이제 상층액 0.1mL를 새 유리관에 옮깁니다. 포도당 산화효소 과산화효소 시약 3mL를 첨가하고 샘플을 50C에서 20분 동안 배양합니다. 각 빈 샘플 용액 200L와 표준 용액을 96웰 플레이트에 조심스럽게 피펫팅합니다.
블랭크 용액에 대해 510nm에서 각 샘플의 흡광도를 측정하고 공식을 사용하여 저항성 전분 함량을 계산합니다. 마지막으로 참가자에게 물 200mL와 함께 준비된 쌀 50g을 제시합니다. 식사 후 다양한 시점에서 정맥혈 샘플을 수집하여 혈당 분석을 수행합니다.
저항성 전분 함량은 SBEIIb 돌연변이가 야생형에 비해 5.2%로 유의하게 높았다. 준비된 쌀을 섭취하면 15분과 30분에 포도당 반응이 느려지고 감소하여 각각 9.7%와 3.7% 감소했습니다.
