야생형 성체 마우스의 골수에서 대식세포를 추출하려면 10% FBS 및 10% LCCM이 보충된 DMEM이 포함된 96웰 광학 처리된 평평한 바닥 플레이트에 골수 세포를 플레이트화합니다. 섭씨 37도에서 7%의 이산화탄소로 10일 동안 세포를 배양합니다. 분화 후, 75 마이크로리터의 Mycobacterium abscessus 현탁액을 웰이 포함된 대식세포에 피펫팅합니다.
섭씨 37도에서 7%의 이산화탄소로 4시간 동안 세포를 배양합니다. 작은 카세트가 장착된 마이크로플레이트 시약 디스펜서를 사용하여 10% FBS 및 10% LCCM이 보충된 110마이크로리터의 DMEM을 화합물 또는 용매 제어 컬럼에 추가합니다. 10% FBS 및 10% LCCM이 보충된 추가 104마이크로리터의 DMEM을 화합물 또는 용매의 최고 농도가 포함된 컬럼에 분주합니다.
이제 5.9 마이크로리터의 화합물 또는 용매를 컬럼의 지정된 웰에 피펫팅합니다. 다중 채널 마이크로피펫을 사용하여 각 화합물 및 용매에 대해 두 번의 연속 희석을 수행합니다. 마지막 희석 후 마지막 웰에서 초과 110 마이크로 리터의 매체를 버리십시오.
10%FBS 및 10%LCCM이 보충된 110마이크로리터의 DMEM을 빈 웰을 제외한 모든 컬럼에 추가합니다. DMEM에서 밀리리터당 2마이크로그램 농도의 클래리스로마이신 용액을 준비합니다. 배양 후 감염된 대식세포가 들어 있는 96웰 플레이트를 인큐베이터에서 제거합니다.
플레이트 세척기를 사용하여 200 마이크로리터의 감염 세척 용액으로 세포를 세 번 세척합니다. 200 마이크로리터의 화합물을 감염된 대식세포가 들어있는 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음 200 마이크로리터의 보충된 세포 배양 배지와 클래리스로마이신 용액을 각각의 웰에 추가합니다.
섭씨 37도에서 7%의 이산화탄소로 접시를 48시간 동안 배양합니다. 배양 후 감염된 세포를 200 마이크로리터의 화합물 세척 용액으로 각각 3회 세척합니다. 다중 채널 마이크로피펫을 사용하여 200마이크로리터의 고정 용액을 모든 웰에 분주하고 10분 동안 배양합니다.
세포를 세척한 후 200마이크로리터의 투과성 용액을 모든 웰에 옮기고 15분 동안 배양합니다. 다음으로, 100마이크로리터의 염색 용액을 모든 웰에 추가하기 전에 투과성 용액을 흡입합니다. 실온에서 30분 동안 배양합니다.
배양 후 200 마이크로 리터의 화합물 세척 용액으로 세포를 3 회 세척합니다. High-Content 이미징 시스템을 사용하여 플레이트를 스크리닝하려면 Plate Type(플레이트 유형)을 96 microtiter plate(96 마이크로타이터 플레이트)로 선택합니다. 0.4 개구수와 초점 모드를 가진 20X의 대물렌즈.
그런 다음 DAPI, CellMask deep red 및 mCherry 채널을 선택하여 염색된 핵, 세포질 및 박테리아 신호를 각각 캡처합니다. 플레이트의 웰과 분석을 위해 각 웰의 각 필드를 선택합니다. 그런 다음 테스트를 클릭하고 이미지를 캡처하여 설정을 확인합니다.
마지막으로, 하룻밤 사이에 이미지 획득을 자동화하도록 장비 핸들링 로봇을 설정합니다. 이 로봇 팔은 사람의 개입 없이 High-Content Imaging 시스템의 플레이트를 교환합니다. 다우노루비신(daunorubicin), 독소루비신(doxorubicin), 티오스트렙톤(thiostrepton), 에피루비신(epirubicin), 피르비늄 파모에이트(pyrvinium pamoate) 화합물은 마이코박테리아에 감염된 대식세포에 독성을 가지고 있어 세포 생존율이 85% 미만이었습니다.
화합물 목살락탐과 베시플록사신은 13.3 마이크로몰에서 마이코박테리아 생존율이 50% 미만이었지만 DMSO 대조군과 유의한 차이는 보이지 않았습니다. 화합물 cefdinir, gatifloxacin 및 moxifloxacin은 13.3 micromolar에서 세포 내 마이코박테리아에 대해 강력했으며 화합물 pyrvinium pamoate가 가장 활성이었습니다. 화합물인 록시트로마이신(roxithromycin), 클래리스로마이신(clarithromycin) 및 리파부틴(rifabutin)은 세포 내 마이코박테리아에 대해 극도의 효능을 보였으며 클라리스로마이신은 모든 농도에서 마이코박테리움 생존율을 10% 미만으로 감소시켰습니다.
