외상 기계를위한 육군-UNL 센터 (국방부 / ARO, # W911NF-11-1-0033, PI : 박사 Namas 찬드라), UNL 뜻하는 상 (26-1110-0033 -001 저자는 자금 소스를 감사드립니다 , PI : 임).

1. Neuronal 세포 배양 <ol><li> neuronal 세포, astrocytes, 그들의 공동 문화 등 뇌 세포가 세포 모델로 사용할 수 있습니다. 타당성 데모로서, 셀 라인 neuronal 세포의 충동 가압이 제공됩니다. </li><li> SH-SY5Y 인간 neuroblastoma 세포 (ATCC, CRL-2266)은 18mm 직경의 유리 coverslips에 배양되어 있습니다. 셀 3의 밀도에 놓는 아르 × DMEM로 구성된 성장 미디어를 사용 10 3 셀 / cm 2 10% 태아 소 혈청과 1퍼센트 페니실린 - 스트렙토 마이신과 보충. 세포 배양 유리 슬라이드는 37 ° C.에서 5 % CO 2 humidified 인큐베이터에 보관 </li><li> SH-SY5Y 세포의 neuronal 세포 분화를 구하려면 셀이 추가로 미디어를 7 일 동안 10 μM retinoic 산 (RA)로 보충 미디어와 취급 이틀마다 변경했습니다. 일 7, 세포는 가압 될 준비가 된 것입니다. </li></ol> 2. 가압 설비 : Kolsky 바 <ol><li> Kolsky 바, 드1949 년 Kolsky 1 일까지 veloped, 매우 높은 로딩 속도에서 재료의 기계적 성질을 측정하기 위해 사용되었습니다. 장치는 바 사이의 접촉에 배치 샘플과 막대가 두 개로 구성되어 있습니다. 사건 표시 줄에 생성 된 응력 파, 파도가 반영하고 전송 파도로 분할 샘플로 전파합니다. 샘플에서 스트레스가 전송 파도에 비례합니다. 본 연구에서는, 우리는 설정 Kolsky의 두 바 사이에 위치 할 셀 가압 챔버를 사용합니다. </li><li> 두 알루미늄 합금 바 (각 6 m 길이)를 정렬 황동 베어링에 의해 정지되며, 체외 세포 가압 챔버에서이 막대 사이에 끼어 있습니다. 상류 바 한쪽 끝에 고정 130파운드 질량과 사고 바 있습니다. 마찰 클램프가 원하는 펄스 기간을 제공하는 위치에 배치됩니다. 클램프의 관심을 유도하고 질량 및로드 지원 사이의 가위 잭을 강화함으로써, 사고 바 클램프 - 질량 섹션 사전-C입니다원하는 수준 ompressed. 유압 시스템에 갑자기 휴식에 클램프를 잠급 노치 볼트를 강요하는 것은 빠르게 미리 저장된 압축을 출시하기 때문에 압력 펄스를 생성합니다. 이 사건 바을 통해 전파, 테스트 챔버 피스톤 드라이브, 충동 챔버 내의 유체 및 세포를 pressurizes. 차례로 챔버 압력은 전송 바 하류에 전파 압력 펄스를 시작합니다. 바에서의 압력 펄스와 관련된 변종이 45 볼트에 흥분 복합 높은 저항 스트레인 게이지로 측정하고 있습니다. 게이지 신호는로드의 역사 제 1 MHz의 주파수에서 디지털 오실로스코프로 기록됩니다. </li><li> 체외 세포 가압 챔버에서는 피스톤 실린더로 구성되어 있습니다. 실린더는 2.6 cm 내부 직경 3.8 cm 외경을 가지고 있으며, 캐비티의 밑바닥에 도청 작은 구멍이 있습니다. 그 구멍은 세포 샘플 설치하는 동안 공기와 과도한 유체 배출구 역할을합니다. 피스톤은 7.5 cm 길이와 동일한 바 소재로 만들어진다. 피스톤은 낮은 마찰 인감의 역할 배관공 (테플론) 테이프 2 ~ 3 층으로 싸여 있습니다. 엔드 캡은 오래 32mm이며, 로딩 중에 유리 coverslips을 (세포 배양되는에) 확보 두 개의 작은 스테인레스 스틸 나사가 있습니다. </li></ol> 3. Neuronal 셀의 충동 가압 <ol><li> 모든 가압 챔버 부품은 압력솥을 사용하여 소독하고 UV 빛 아래에서 유지됩니다. 챔버의 조립은 세포 배양 후드 안쪽에 수행됩니다. 챔버의 배기 나사가 느슨하게 구멍의 밑바닥에 공기에 종사하고 있습니다. 사전 예열 (37 ° C) 신선한 성장 미디어 거품을하지 않고 챔버에 pipetted 있습니다. 그런 다음 셀 배양 유리 슬라이드는 픽업하고 있으며, (외부에 직면 세포) 피스톤의 뚜껑에 표시됩니다. 작은 보유 나사는 그 자리에 개최 할 수있는 슬라이드에 아래로 강화됩니다. 세포 배양 유리 슬라이드와 피스톤 삽입 조금 전n 인물 챔버의 구멍, 그리고 어셈블리가 가장 높은 지점에서되는 통풍구를 기울입니다. 배기 나사가 제거되고 피스톤을 먼저 한 다음 기포, 과도한 유체를 강요 구멍에 밀어 있습니다. 어느 참조 마크 나 지그는 모든 테스트에 동일한 문화 미디어 볼륨을 보장하기 위해 가이드로 사용됩니다. 챔버에있는 미디어의 축 크기가 6mm에 있습니다. 배기 나사를 살균하고 꽉 챔버 물을 만들기 위해 그것을 교체하십시오. 챔버는 않는 경우, 테플론 랩이 교체하거나 강화해야 할이 정적 하중에 따라 누출해서는 안됩니다. </li><li> 이 시점에서, Kolsky 바 시스템이 재설정됩니다. 무거운 질량은 원래의 위치로 다시 이동하고 새로운 잠금 볼트는 사용 된 (깨진)를 대체합니다. 약 200 PSI에 유압으로 새로운 잠금 볼트를 유도합니다. 원하는 값보다 약간 높은 압력으로 사건 바의 사전로드 섹션을 압축 가위 잭을 사용하고, 다음의 전체 마찰을 참여 할을 백업잭의 나사. 데이터 수집은 이제 무장되어 있습니다. </li><li> 조립 셀 가압 챔버는 시스템에 장착된다. 그것은 작은 실험실 가위 잭에서 지원하는 V 블록에 배치하고 두 개의 막대로 정렬되어 있습니다. 가벼운 기름 층 사이에 에어 갭을 제거하는 함께 간섭 표면을 문질러과 그리스 각 인터페이스에서 수행 할 수 있습니다. </li><li> 시험은 이제 시작 할 준비가되어 있습니다. 클램프 잠금 볼트는 빠르게 유압 클램프 드라이버를 펌핑하여 침입을 강요하고 있습니다. 결과를 클램프가 분리되며 데이터 수집이 표시됩니다. 세포 가압 내역은 전송 바 게이지의 측정에서 결정됩니다. 사용 된 전송 표시 줄이 충분히 인 경우 측정이 부정적인 압력을 게재 위치이는 지점에 첫 번째 장애에서해야합니다. 거품이 덫 경우 전송 펄스의 기간은 사건 펄스보다 짧을 수 있습니다. 크기는 사건 펄스의 도달하지 않을 수 있습니다,하지만 충분히 경도가 있어야합니다하역하기 전에 g 고원. 그렇지 않으면, 밀봉 된 챔버 또는 어셈블리 및 바 사이의 misalignment에서 큰 기포 하나가 발생했을 수도 있습니다. </li><li> 세포 가압 챔버 그런 다음 제거하고 세포 배양 후드 내부 분해된다. 배기 나사가 제거되고 피스톤이 챔버의 무료 당겨 있습니다. 세포 배양 유리 슬라이드는 피스톤의 끝에서 가져옵니다. </li></ol> 4. 가압 셀 행동을 평가 <ol><li> 가압 후, 세포는 즉시 검사 할 수 있습니다 또는 더 이상 시험을 incubated. 적절한 무균 조작 과정을 통해 장기적 후 부화이 가능합니다. </li><li> 가압 셀은 모든 분자와 세포 생물학 기법을 면밀히 검토 할 수 있습니다. 특히 neuronal 세포 가압를 들어, assays는 neurite 가지의 압력 유발 변경, 미세 소관 cytoskeletal 변화, neuronal 유전자 expre을 평가, 외상성 뇌 손상 조건에서 세포와 분자 생리학을 조사 할 수ssion, apoptosis 등은 수행 할 수 있습니다. 제어 세포 샘플, 동일한을 배양 아르 세포는 같은 기간 동안 가압 챔버 내부에 보관하지만, 가압되지는 (그래서, 챔버 제어를 호출)를 사용 때문입니다. </li><li> neurite 가지의 변화를 평가를 들어, 가압 및 챔버 제어 셀은 즉시 가압 및 사후 부화의 1, 24 H 후 광학 현미경으로 검사합니다. neuronal 세포 이미지의 예는 &#39;대표 결과&#39;섹션 (그림 2)에 표시됩니다. neurite 길이 변경 고를 immunofluorescent 착색 및 이미지 분석하여 정량화 할 수 있습니다. 셀은 0.05 % V / V 트윈-20 세척 버퍼로 헹구어 4 % W / V paraformaldehyde 솔루션으로 고정하고, 0.1 % 브이 / v 튼 X-100 솔루션을 permeabilized 있습니다. 1 % w / v를 소 혈청 알부민 솔루션으로 차단 한 후에 세포 tetramethylrhodamine의 isothiocyanate (TRITC) - 복합 phalloidin와 incubated 수 있습니다. 셀의 Immunofluorescent 이미지는 형광등을 사용하여 이동합니다현미경과 가압 및 제어 세포에 대한 neurites의 길이는 ImageJ 소프트웨어 (NIH)를 사용하여 평가합니다. </li><li> neurites는 axons 또는 수석으로 식별 할 수 있습니다. axons 또는 수석의 형태학의 변화를 평가하기 위해 실험 위에서 설명한 각 구조를 검출 항체를 사용하여 반복 할 수 있습니다, 즉 수석에 대한 axons와 미세 소관 - 관련 단백질 (MAP2) 항체에 대한 neurofilament (NF) 항체. </li><li> 미소는 뉴런의 핵심 cytoskeletal 구성 요소 중 하나이며, 미소에 손상 neuronal 부상의 마커로 사용되었습니다.이 미세 소관은 β-tubulin 항체를 사용하여 immunofluorescently 시각화 할 수 있습니다. 셀은 후 가압 0, 24 H 후 고정 β-tubulin 항체 물들과 형광 현미경에 의해 관찰된다. </li><li> neuronal 및 apoptotic 유전자 발현에 대한 충동 가압의 효과를 평가하기 위해, 총 RNA는 가압 및 제어 세포에서 추출됩니다. 일반전자의 발현은 우리의 게시 된 프로토콜과 유사 정량 RT-PCR 또는 실시간 RT-PCR을 수행하여 검사를 할 수 있습니다. 3 </li></ol> 5. 대표 결과 : <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1. 압력 프로파일의 예는 가압 챔버 내에서 세포에 적용. Kolsky 바 장치를 성공적으로 0.7에 대한 MS의 기간이있는 2 MPA 수준, 단일 펄스 타입 충동적인 가압를 생성합니다. <img src="/files/ftp_upload/2723/2723fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 충동 가압에 neuronal 세포 응답의 예라고 할 수 있습니다. SH-SY5Y 세포는 챔버 제어 세포에 비해 두 MPA 쇼 독특한 neurite / 축삭 고장에서 충동 적 가압에 노출. 6. 어려움과 솔루션 <ol><li> 상공 회의소 실링은 극복 할 주요 장애물 중 하나입니다. 그것은 강한 것입니다O-링과 다양한 디스크 가우 징 및 증가 마찰의 문제를 가지고 놀이. 마찰 효과를 제거뿐만 아니라 가우 징, 테플론 배관 테이프 피스톤 녹음의 간단한 방법을 방지하기 위해 사용됩니다. 이 문제를 해결하여 원하는 압력 수준과 기간을 생산하고 있습니다. </li><li> 가압 neuronal 세포 행동은, 보조 외상성 뇌 손상 메커니즘이나 장기적 효과를 평가 특히 오랜 후 배양 시간 후에 검사해야합니다. 세포 함유 챔버는 Kolsky 바로 이동 pressurizing 및 세포 배양 후드로 다시 이동하는 동안 잠재적 인 조건을 unsterile에 노출되어 있습니다. 챔버 부품 및 / 분해 세포 배양 후드 내부의 세포 배양 슬라이드와 챔버의 조립에 적절한 작업의 사전 살균을 통해 장기적인 후 부화는 몇 주까지 가능합니다. </li><li> 데이터의 재현성 세포 기계 자극 실험에서 중요한 매개 변수입니다. 우리의 장치 reproducibilit에 대한neuronal 세포 응답의 Y는 충동 적 가압 프로필을 원하는 방법을 결정, 압력 수준과 기간 모두에서 반복적으로 얻어진다. 우리가 각 가압 용 얻은 압력 프로파일을 기록하기 때문에, 원치 않는 압력 프로필에서 세포 응답 데이터를 수동으로 나중에 제외 할 수 있습니다. </li><li> 챔버 조립, 전송 및 Kolsky 바, 가압, 전송 - 다시, 그리고 챔버 분해에 마운트를 포함한 전체 가압 단계는, 이하의 10 분을. 다음 세포 배양 슬라이드는 이전 가압 후 바로 가압 될 수 있습니다. 따라서, 가압 실험의 충분한 수를 효율적으로 완료 할 수 있습니다. 우리의 설정은 18mm 직경 유리 coverslips을 활용합니다. 하나의 가압 실험은 기판의 크기로 인해 immunoblotting 서쪽에 충분한 단백질을 (그리고 또한 부분적으로 가압 세포의 일부가 죽었 때문에) 제공하지 않습니다. 세명의 반복 가압 실험은 immunobl에 필요한 단백질 양을 제공합니다otting. 다시 말하지만, 재현성이 압력 프로필로 할 때마다 검사합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Kolsky, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+investigation+of+mechanical+properties+of+materials+at+very+high+rates+of+loading.">An investigation of mechanical properties of materials at very high rates of loading.</a> Prec. Phys. Soc. London. 62, 676-700 (1949).</li><li>Tang-Schomer, M. D., Patel, A. R., Baas, P. W., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+breaking+of+microtubules+in+axons+during+dynamic+stretch+injury+underlies+delayed+elasticity,+microtubule+disassembly,+and+axon+degeneration.">Mechanical breaking of microtubules in axons during dynamic stretch injury underlies delayed elasticity, microtubule disassembly, and axon degeneration.</a> FASEB. J. 24, 1401-1410 (2010).</li><li>Lim, J. Y., Taylor, A. F., Li, Z., Vogler, E. A., Donahue, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrin+expression+and+osteopontin+regulation+in+human+fetal+osteoblastic+cells+mediated+by+substratum+surface+characteristics.">Integrin expression and osteopontin regulation in human fetal osteoblastic cells mediated by substratum surface characteristics.</a> Tissue. Eng. 11, 19-29 (2005).</li><li>Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+approaches+for+studying+blast-induced+traumatic+brain+injury.">In vitro approaches for studying blast-induced traumatic brain injury.</a> J. Neurotrauma. 26, 861-876 (2009).</li><li>Ling, G., Bandak, F., Armonda, R., Grant, G., Ecklund, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Explosive+blast+neurotrauma.">Explosive blast neurotrauma.</a> J. Neurotrauma. 26, 815-825 (2009).</li><li>Shepard, S. R., Ghajar, J. B. G., Giannuzzi, R., Kupferman, S., Hariri, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluid+percussion+barotrauma+chamber:+a+new+in+vitro+model+for+traumatic+brain+injury.">Fluid percussion barotrauma chamber: a new in vitro model for traumatic brain injury.</a> J. Surg. Res. 51, 417-424 (1991).</li><li>VandeVord, P. J., Leung, L. Y., Hardy, W., Mason, M., Yang, K. H., King, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+reactivity+and+survival+genes+in+astrocytes+after+exposure+to+short+duration+overpressure.">Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure.</a> Neurosci. Lett. 434, 247-252 (2008).</li><li>Huang, H., Feng, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+study+of+the+dynamic+tribological+response+of+closed+fracture+surface+pairs+by+Kolsky-bar+compression-shear+experiment.">A study of the dynamic tribological response of closed fracture surface pairs by Kolsky-bar compression-shear experiment.</a> Int. J. Solids. Struct. 41, 2821-2835 (2004).</li><li>Song, B., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+Hopkinson+pressure+bar+techniques+for+characterizing+soft+materials.">Split Hopkinson pressure bar techniques for characterizing soft materials.</a> Lat. Am. J. Solids. Struct. 2, 113-152 (2005).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

체외 실험 기술의 대부분은 외상성 뇌 손상 조건에서 뇌 세포 손상을 공부를 위해 시도되었습니다. 이러한 이것은 짧은 기간 과압이 외상성 뇌 손상에 대한 지배 물리적 요소입니다 것으로 간주되었습니다 / astrocyte 스트레칭, 흐름 유도 전단 응력 신경 세포, 체중 드롭, 스타일러스가 찢어진, 레이저 절개, lithotripsy 등 4,5이 포함되어 있습니다. 특히 6,7를 , 외상성 뇌 손상 폭발의 충격파는 밀리 초의 주문 펄스 기간이 있습니다. 4 이러한 가정하고 관찰을 바탕으로, 과도 가압 할 수있는 기압계 챔버는 개발 및 외상성 뇌 손상 조건 하에서 뇌 세포의 행동을 평가에 사용되었습니다. 예를 들어, 유체 타악기 barotrauma 챔버 0.5 MPA에 20-30 밀리 긴 기간 및 최대 피크 압력과 압력 펄스에 외상성 뇌 손상에서 인간 glial 세포의 동작을 검사하는 데 사용되었다. 6 최근 VandeVord 외 7. 사용 금속 astrocyte 세포를 검사하기 위해 볼 인상적인 기압계 챔버외상성 뇌 손상에 따라 행동하지만, 금속 공을 여러 압력 펄스를 생산 놀라운. 본 연구에서는, 우리는 단일 펄스 타입 충동적인 압력을 생성하는 새로운 세포 가압 장치를 개발했습니다. 장치는 우리의 8 기타의 연구 재료 시험 장치로 사용 된 Kolsky 바 설정을 기반으로 개발되었습니다. 매우 높은 로딩 속도 1,9 Kolsky 바의 재료 시험 기능을 할 수 있다는 것이 수정되었습니다 가압 챔버 (그림 1)에서 배양 세포에 단일 펄스 형 압력을 적용합니다. 우리는 성공적으로 충동적인 압력의 크기와 기간을 조절할 수 있습니다. 대표 셀 응답, 우리는 unpressurized 챔버 제어 세포에 비해 두 MPA 압력 SH-SY5Y neuronal 세포에서 중요한 neurite 및 axonal 손실을 표시 보여 주었다. 결론적으로, 우리는 특별히 고안된 Kolsky을 사용하여 새로운 충동 셀 가압 장치를 개발바 장치와는 외상성 뇌 손상 조건에서 neuronal 세포 반응을 조사에 잠재적 인 사용을 보여 주었다. 우리는 또한이 기술은 세포의 종류가 다양한 수준과 기간에 충동 적 압력에 노출 될 수 있다는 매우 다양한됩니다. 따라서 장치는 세포의 손상뿐만 아니라 적극적으로 자신의 기능과 운명 결정에 세포를 자극 용뿐 아니라, 충동 적 압력 유발 세포 mechanotransduction의 동작을 조사하는 데 사용할 수 있습니다.

<ul><li> SH-SY5Y (ATCC, CRL-2266) 인간 neuroblastoma 세포에게 </li><li> 18mm 직경 유리 coverslips </li><li> 세포 배양 매체 : DMEM, 10 % 태아 소 혈청, 1 % 페니실린 - 스트렙토 마이신 </li><li> 유도 neurogenesis에 대한 Retinoic 산 (10 μM) </li><li> Kolsky 바 충동 가압 장치 </li><li> 피스톤 실린더 세포 가압 챔버 </li><li> 피스톤에 세포 배양 coverslip 보안을위한 스테인리스 나사 </li><li> 셀 챔버와 Kolsky 바 사이의 인터페이스에 대한 그리스 </li><li> 가압 (정착액, 항체, 형광 염료, PCR 용품, 등)에 세포 반응을 평가하기위한 일반 분자 생물학 공급 </li></ul>

impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study

소설 충동 세포 가압 실험은 폭발 유발 외상성 뇌 손상을 (외상성 뇌 손상) 조사 Kolsky 바 장치를 사용하여 개발되었습니다. 우리는 폭발 외상성 뇌 손상과 관련된 충동 가압는 체외에서 neuronal 세포에 적용하는 방법이 비디오 문서에 보여줍니다. 이것은 기록 된 세포 가압 챔버 내에서 전체 압력 역사와 함께 전문 Kolsky 바 장치에 의해 생성 잘 제어 압력 펄스를 사용하여 달성된다. 가압 neuronal 세포는 가압 한 후 즉시 검사, 또는 서로 다른 neurite 손실 친척을 유도 우리는 약 2 MPA에 그 충동 가압을 관찰 axonal / neurite 가지, neuronal 유전자 발현, apoptosis 등의 충동 가압의 장기적인 효과를 검토 할 더 incubated 아르 unpressurized 세포합니다. 우리 기술은 잘 제어 PR에서 뇌 세포의 충동 가압을 통해, 외상성 뇌 손상 폭발의 분자 / 세포 메커니즘을 조사 할 새로운 방법을 제공합니다크기와 기간을 essure.

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Impulsive Pressurization of Neuronal Cells for Traumatic Brain Injury Study

소설 충동 세포 가압 실험은 폭발 - 유도 외상성 뇌 손상의 분자 / 세포 메커니즘을 조사하기 위해 Kolsky 바 장치를 사용하여 개발되었습니다.

외상성 뇌 손상 연구를위한 Neuronal 셀의 충동 가압

A novel impulsive cell pressurization experiment has been developed using a Kolsky bar device to investigate blast-induced traumatic brain injury (TBI). ...

impulsive-pressurization-neuronal-cells-for-traumatic-brain-injury

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.1K 조회수.  University of Nebraska-Lincoln. 소설 충동 세포 가압 실험은 폭발 - 유도 외상성 뇌 손상의 분자 / 세포 메커니즘을 조사하기 위해 Kolsky 바 장치를 사용하여 개발되었습니다.

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Micropatterned Surfaces to Study Hyaluronic Acid Interactions with Cancer Cells

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix (ECM) components within the tumor microenvironment. Hyaluronic acid (HA) is one stromal ECM component that is known to facilitate tumor progression by enhancing invasion, growth, and angiogenesis1. Interaction of HA with its cell surface receptor CD44 induces signaling events that promote tumor cell growth, survival, and migration, thereby increasing metastatic spread2-3. HA is an anionic, nonsulfated glycosaminoglycan composed of repeating units of D-glucuronic acid and D-N-acetylglucosamine. Due to the presence of carboxyl and hydroxyl groups on repeating disaccharide units, native HA is largely hydrophilic and amenable to chemical modifications that introduce sulfate groups for photoreative immobilization 4-5. Previous studies involving the immobilizations of HA onto surfaces utilize the bioresistant behavior of HA and its sulfated derivative to control cell adhesion onto surfaces6-7. In these studies cell adhesion preferentially occurs on non-HA patterned regions.
To analyze cellular interactions with exogenous HA, we have developed patterned functionalized surfaces that enable a controllable study and high-resolution visualization of cancer cell interactions with HA. We utilized microcontact printing (uCP) to define discrete patterned regions of HA on glass surfaces. A "tethering" approach that applies carbodiimide linking chemistry to immobilize HA was used 8. Glass surfaces were microcontact printed with an aminosilane and reacted with a HA solution of optimized ratios of EDC and NHS to enable HA immobilization in patterned arrays. Incorporating carbodiimide chemistry with mCP enabled the immobilization of HA to defined regions, creating surfaces suitable for in vitro applications. Both colon cancer cells and breast cancer cells implicitly interacted with the HA micropatterned surfaces. Cancer cell adhesion occurred within 24 hours with proliferation by 48 hours. Using HA micropatterned surfaces, we demonstrated that cancer cell adhesion occurs through the HA receptor CD44. Furthermore, HA patterned surfaces were compatible with scanning electron microscopy (SEM) and allowed high resolution imaging of cancer cell adhesive protrusions and spreading on HA patterns to analyze cancer cell motility on exogenous HA.

A novel approach that allows the high-resolution analysis of cancer cell interactions with exogenous hyaluronic acid (HA) is described. Patterned surfaces are fabricated by combining carbodiimide chemistry and microcontact printing.

Micropatterned 표면은 암세포와 Hyaluronic 산성 상호 작용을 연구하기 위해

Cancer invasion and progression involves a motile cell phenotype, which is under complex regulation by growth factors/cytokines and extracellular matrix ...

연구

생체공학

Transplantation of Induced Pluripotent Stem Cell-derived Mesoangioblast-like Myogenic Progenitors in Mouse Models of Muscle Regeneration

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells similar to pericyte-derived mesoangioblasts (iPSC-derived mesoangioblast-like stem/progenitor cells: IDEMs) can be established from iPSCs generated from patients affected by different forms of muscular dystrophy. Patient-specific IDEMs can be genetically corrected with different strategies (e.g. lentiviral vectors, human artificial chromosomes) and enhanced in their myogenic differentiation potential upon overexpression of the myogenesis regulator MyoD. This myogenic potential is then assessed in vitro with specific differentiation assays and analyzed by immunofluorescence. The regenerative potential of IDEMs is further evaluated in vivo, upon intramuscular and intra-arterial transplantation in two representative mouse models displaying acute and chronic muscle regeneration. The contribution of IDEMs to the host skeletal muscle is then confirmed by different functional tests in transplanted mice. In particular, the amelioration of the motor capacity of the animals is studied with treadmill tests. Cell engraftment and differentiation are then assessed by a number of histological and immunofluorescence assays on transplanted muscles. Overall, this paper describes the assays and tools currently utilized to evaluate the differentiation capacity of IDEMs, focusing on the transplantation methods and subsequent outcome measures to analyze the efficacy of cell transplantation.

Induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived myogenic progenitors are promising candidates for cell therapy strategies to treat muscular dystrophies. This protocol describes transplantation and functional measurements required to evaluate the engraftment and differentiation of iPSC-derived mesoangioblasts (a type of muscle progenitors) in mouse models of acute and chronic muscle regeneration.

근육 재생의 마우스 모델에서 유도 만능 줄기 세포 유래 메소안지오블라스트 와 같은 근생 성 전구의 이식

Patient-derived iPSCs could be an invaluable source of cells for future autologous cell therapy protocols. iPSC-derived myogenic stem/progenitor cells ...

A Novel Three-dimensional Flow Chamber Device to Study Chemokine-directed Extravasation of Cells Circulating under Physiological Flow Conditions

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell homing and tumor metastasis. The three-dimensional flow chamber device (hereafter the 3D device) is a novel in vitro technology that recreates physiological shear stress and allows each step of the cell extravasation cascade to be quantified. The 3D device consists of an upper compartment in which the cells of interest circulate under shear stress, and a lower compartment of static wells that contain the chemoattractants of interest. The two compartments are separated by porous inserts coated with a monolayer of endothelial cells (EC). An optional second insert with microenvironmental cells of interest can be placed immediately beneath the EC layer. A gas exchange unit allows the optimal CO2 tension to be maintained and provides an access point to add or withdraw cells or compounds during the experiment. The test cells circulate in the upper compartment at the desired shear stress (flow rate) controlled by a peristaltic pump. At the end of the experiment, the circulating and migrated cells are collected for further analyses. The 3D device can be used to examine cell rolling on and adhesion to EC under shear stress, transmigration in response to chemokine gradients, resistance to shear stress, cluster formation, and cell survival. In addition, the optional second insert allows the effects of crosstalk between EC and microenvironmental cells to be examined. The translational applications of the 3D device include testing of drug candidates that target cell migration and predicting the in vivo behavior of cells after intravenous injection. Thus, the novel 3D device is a versatile and inexpensive tool to study the molecular mechanisms that mediate cellular extravasation.

The three-dimensional flow chamber device is a novel in vitro technology for the quantitative and step-wise evaluation of the extravasation cascade of cells circulating under conditions of physiological shear stress. The device therefore fills a critical need for basic, preclinical, and clinical studies of cell migration.

생리 흐름 조건에서 순환 세포의 케모카인 - 감독 넘쳐을 연구하는 소설 입체 흐름 챔버 장치

Extravasation of circulating cells from the bloodstream plays a central role in many physiological and pathophysiological processes, including stem cell ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

라이브 이미징 및 상해 응답의 연구에 대한 마이크로 유체 칩을 사용<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

Luminescence Resonance Energy Transfer to Study Conformational Changes in Membrane Proteins Expressed in Mammalian Cells

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range of 10-100 &#197;. By measuring the distances under various ligated conditions, conformational changes of the protein can be easily assessed. With LRET, a lanthanide, most often chelated terbium, is used as the donor fluorophore, affording advantages such as a longer donor-only emission lifetime, the flexibility to use multiple acceptor fluorophores, and the opportunity to detect sensitized acceptor emission as an easy way to measure energy transfer without the risk of also detecting donor-only signal. Here, we describe a method to use LRET on membrane proteins expressed and assayed on the surface of intact mammalian cells. We introduce a protease cleavage site between the LRET fluorophore pair. After obtaining the original LRET signal, cleavage at that site removes the specific LRET signal from the protein of interest allowing us to quantitatively subtract the background signal that remains after cleavage. This method allows for more physiologically relevant measurements to be made without the need for purification of protein.

We describe here an improved Luminescence Resonance Energy Transfer (LRET) method where we introduce a protease cleavage site between the donor and acceptor fluorophore sites. This modification allows us to obtain specific LRET signals arising from membrane proteins of interest, allowing for the study of membrane proteins without protein purification.

발광 공명 에너지는 포유 동물 세포에 표현 막 단백질의 구조 변화를 연구에 전송

Luminescence Resonance Energy Transfer, or LRET, is a powerful technique used to measure distances between two sites in proteins within the distance range ...

Training Persons with Spinal Cord Injury to Ambulate Using a Powered Exoskeleton

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper extremity function and are able to maintain upright balance using forearm crutches. To ambulate in an exoskeleton, the user must acquire the ability to maintain balance while standing, sitting and appropriate weight shifting with each step. This can be a challenging task for those with deficits in sensation and proprioception in their lower extremities. This manuscript describes screening criteria and a training program developed at the James J. Peters VA Medical Center, Bronx, NY to teach users the skills needed to utilize these devices in institutional, home or community environments. Before training can begin, potential users are screened for appropriate range of motion of the hip, knee and ankle joints. Persons with SCI are at an increased risk of sustaining lower extremity fractures, even with minimal strain or trauma, therefore a bone mineral density assessment is performed to reduce the risk of fracture. Also, as part of screening, a physical examination is performed in order to identify additional health-related contraindications. 
Once the person has successfully passed all screening requirements, they are cleared to begin the training program. The device is properly adjusted to fit the user. A series of static and dynamic balance tasks are taught and performed by the user before learning to walk. The person is taught to ambulate in various environments ranging from indoor level surfaces to outdoors over uneven or changing surfaces. Once skilled enough to be a candidate for home use with the exoskeleton, the user is then required to designate a companion-walker who will train alongside them. Together, the pair must demonstrate the ability to perform various advanced tasks in order to be permitted to use the exoskeleton in their home/community environment.

Training a person with paralysis to ambulate using a powered exoskeleton may present challenges. The goals are to present the candidate selection criteria and the training procedures for exoskeletal-assisted walking and other mobility skills that can be progressed as the participant's skill level improves.

척수 손상이있는 사람을 교육하는 것은 동력 형 외골격을 사용 Ambulate하기

Powered exoskeletons have become available for overground ambulation in persons with paralyses due to spinal cord injury (SCI) who have intact upper ...

Three-dimensional Tissue Engineered Aligned Astrocyte Networks to Recapitulate Developmental Mechanisms and Facilitate Nervous System Regeneration

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to replace lost neurons and regenerate axonal pathways. However, during nervous system development, neuronal migration and axonal extension often occur along pathways formed by other cells, referred to as &#34;living scaffolds&#34;. Seeking to emulate these mechanisms and to design a strategy that circumvents the inhibitory environment of the CNS, this manuscript presents a protocol to fabricate tissue engineered astrocyte-based &#34;living scaffolds&#34;. To create these constructs, we employed a novel biomaterial encasement scheme to induce astrocytes to self-assemble into dense three-dimensional bundles of bipolar longitudinally-aligned somata and processes. First, hollow hydrogel micro-columns were assembled, and the inner lumen was coated with collagen extracellular-matrix. Dissociated cerebral cortical astrocytes were then delivered into the lumen of the cylindrical micro-column and, at a critical inner diameter of &#60;350 &#181;m, spontaneously self-aligned and contracted to produce long fiber-like cables consisting of dense bundles of astrocyte processes and collagen fibrils measuring &#60;150 &#181;m in diameter yet extending several cm in length. These engineered living scaffolds exhibited &#62;97% cell viability and were virtually exclusively comprised of astrocytes expressing a combination of the intermediate filament proteins glial-fibrillary acidic protein (GFAP), vimentin, and nestin. These aligned astrocyte networks were found to provide a permissive substrate for neuronal attachment and aligned neurite extension. Moreover, these constructs maintain integrity and alignment when extracted from the hydrogel encasement, making them suitable for CNS implantation. These preformed constructs structurally emulate key cytoarchitectural elements of naturally occurring glial-based &#34;living scaffolds&#34; in vivo. As such, these engineered living scaffolds may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms in vitro or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding following CNS degeneration in vivo.

We showcase the development of self-assembled, three-dimensional bundles of longitudinally aligned astrocytic somata and processes within a novel biomaterial encasement. These engineered &#34;living scaffolds&#34;, exhibiting micron-scale diameter yet extending centimeters in length, may serve as test-beds to study neurodevelopmental mechanisms or facilitate neuroregeneration by directing neuronal migration and/or axonal pathfinding.

3 차원 조직 설계 정렬 사이토 네트워크 발달 메커니즘을 정리 하 고 신경 재생을 촉진 하

Neurotrauma and neurodegenerative disease often result in lasting neurological deficits due to the limited capacity of the central nervous system (CNS) to ...

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology with great potential for biomedical applications. The technique facilitates the direct deposition of biocompatible polymer fibers to fabricate well-ordered scaffolds in the sub-micron to micro scale range. The establishment of a stable, viscoelastic, polymer jet between a spinneret and a collector is achieved using an applied voltage and can be direct-written. A significant benefit of a typical porous scaffold is a high surface-to-volume ratio which provides increased effective adhesion sites for cell attachment and growth. Controlling the printing process by fine-tuning the system parameters enables high reproducibility in the quality of the printed scaffolds. It also provides a flexible manufacturing platform for users to tailor the morphological structures of the scaffolds to their specific requirements. For this purpose, we present a protocol to obtain different fiber diameters using melt electrospinning writing (MEW) with a guided amendment of the parameters, including flow rate, voltage and collection speed. Furthermore, we demonstrate how to optimize the jet, discuss often experienced technical challenges, explain troubleshooting techniques and showcase a wide range of printable scaffold architectures.

Melt Electrospinning Writing of Three-dimensional Poly(&amp;#949;-caprolactone) Scaffolds with Controllable Morphologies for Tissue Engineering Applications

This protocol serves as a comprehensive guideline to fabricate scaffolds via electrospinning with polymer melts in a direct writing mode. We systematically outline the process and define the appropriate parameter settings for achieving targeted scaffold architectures.

조직 공학 응용 프로그램에 대 한 제어 형태학과 3 차원 Poly(ε-caprolactone) 장비의 전기 글 녹아

This tutorial reflects on the fundamental principles and guidelines for electrospinning writing with polymer melts, an additive manufacturing technology ...

Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for movement disorders and is being applied to a growing number of disorders. Computational modeling has been successfully used to predict the clinical effects of DBS; however, there is a need for novel modeling techniques to keep pace with the growing complexity of DBS devices. These models also need to generate predictions quickly and accurately. The goal of this project is to develop an image processing pipeline to incorporate structural magnetic resonance imaging (MRI) and diffusion weighted imaging (DWI) into an interactive, patient specific model to simulate the effects of DBS. A virtual DBS lead can be placed inside of the patient model, along with active contacts and stimulation settings, where changes in lead position or orientation generate a new finite element mesh and solution of the bioelectric field problem in near real-time, a timespan of approximately 10 seconds. This system also enables the simulation of multiple leads in close proximity to allow for current steering by varying anodes and cathodes on different leads. The techniques presented in this paper reduce the burden of generating and using computational models while providing meaningful feedback about the effects of electrode position, electrode design, and stimulation configurations to researchers or clinicians who may not be modeling experts.

The goal of this project is to develop an interactive, patient-specific modeling pipeline to simulate the effects of deep brain stimulation in near real-time and provide meaningful feedback as to how these devices influence neural activity in the brain.

대화형, 환자 전용 모델을 사용 하 여 깊은 두뇌 자극 치료를 위한 신경 섬유 책자를 대상으로

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...

Hyaluronic-Acid Based Hydrogels for 3-Dimensional Culture of Patient-Derived Glioblastoma Cells

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular matrix (ECM) of the unique brain environment, such as hyaluronic acid (HA), facilitates GBM progression and invasion. However, most in vitro culture models include GBM cells outside of the context of an ECM. Murine xenografts of GBM cells are used commonly as well. However, in vivo models make it difficult to isolate the contributions of individual features of the complex tumor microenvironment to tumor behavior. Here, we describe an HA hydrogel-based, three-dimensional (3D) culture platform that allows researchers to independently alter HA concentration and stiffness. High molecular weight HA and polyethylene glycol (PEG) comprise hydrogels, which are crosslinked via Michael-type addition in the presence of live cells. 3D hydrogel cultures of patient-derived GBM cells exhibit viability and proliferation rates as good as, or better than, when cultured as standard gliomaspheres. The hydrogel system also enables incorporation of ECM-mimetic peptides to isolate effects of specific cell-ECM interactions. Hydrogels are optically transparent so that live cells can be imaged in 3D culture. Finally, HA hydrogel cultures are compatible with standard techniques for molecular and cellular analyses, including PCR, Western blotting and cryosectioning followed by immunofluorescence staining.

Here, we present a protocol for three-dimensional culture of patient-derived glioblastoma cells within orthogonally tunable biomaterials designed to mimic the brain matrix. This approach provides an in vitro, experimental platform that maintains many characteristics of in vivo glioblastoma cells typically lost in culture.

히 알루 론 산 기반 Hydrogels 세포종 환자에서 파생 된 셀의 3 차원 문화에 대 한

Glioblastoma (GBM) is the most common, yet most lethal, central nervous system cancer. In recent years, many studies have focused on how the extracellular ...