이 작품은 검사서 오대호 Bioenergy 연구 센터 (DE-FC02-07ER64494 과학 검사서 BER 사무실)에서 교부금에 의해 지원되었다. 우리는 박사 Xudong 장 및 프로토콜을 마무리 유용한 기술적인 토론과 소중한 의견에 대한 자신의 그룹 회원들에게 감사를드립니다.

1. 샘플 준비 및 산성 추출 <ol><li> 동결 건조 토양 샘플 필드 컬렉션 후. </li><li> 볼 밀, 토양 연삭기, 또는 박격포와 유봉을 사용하여 토양 샘플을 갈아서하고 homogenize. </li><li> 25 ML의 가수 분해 플라스크에 토양 샘플을 (&gt; 0.3 MG N을 포함)의 무게. </li><li> 각 가수 분해 플라스크에 10 ML 6M HCL을 추가 단단히 N 2 flasks의 가스, 뚜껑을 채운다. </li><li> 자동 타이머 스위치를 사용하여 8 시간 105 ° 인큐베이터에서 C에서 Hydrolyze. </li></ol> 2. 샘플 정제 <ol><li> 인큐베이터에서 flasks 제거, 실온에 좋아. </li><li> 소용돌이로 믹스, 각 플라스크 ~ 100 μL 내부 표준 myo-이노시톨을 (물 1 MG ML -1) 추가합니다. </li><li> ST / NS 24 / 안정성을위한 플라스틱 컵에 설정된 40 관절, 200 ML 배 모양의 flasks로 배수 플라스틱 유입​​ 경로를 설정합니다. </li><li> 공간 워트 먼지 # 2 질적 동아리 (11cm 직경) 숙소와 퍼널을에 세트로. </리&gt; <li> 소용돌이 각 가수 분해 플라스크를, 그리고 (당신이 더 이상의 물을 ~ 3 ML 각 플라스크를 헹굴 수 있음) 필터링 깔때기에 슬러리를 붓는다. </li><li> ~ 45 ° C, 신청 진공에서 회전 증발기를 사용하여 여과액 말리. </li><li> 3 ~ 5 ML 물 (필요한 경우 초음파 목욕을 사용) 각 배 플라스크에서 말린 잔류물을 Resuspend, 그리고 40 ML 테플론 튜브에 부어, 물과의 두 번째 나누어지는로 플라스크를 씻어. </li><li> 6.8 석출물 금속 이온과 다른 유기 분자로 1M 코이 솔루션을 사용하여 - 6.6로 산도를 조정합니다. </li><li> 10 분 2000 rcf에서 원심 분리하여 precipitates 제거합니다. </li><li> 40 ML 유리관에 뜨는을 붓고, -20에서 튜브 parafilm와 개방, 동결 ° C를 포함, 다음 parafilm에 구멍을 찌르지. </li><li> 모든 액체를 제거하는 냉동 뜨는을 동결 건조. </li><li> 3 ML 건조 메탄올과 찌꺼기를 해산 (원하는 경우 초음파 목욕을 사용하여) 철저 vortexing, 캡 튜브, 그리고 이주 10 분 동안 2,000 rcf에서 원심 분리기소금 아웃. </li><li> 3 ML 원뿔 반응 유리병에 뜨는 전송, 45 ° C (또는 원하는 경우 건조 질소 가스의 부드러운 스트림 이하)에서 RapidVap 기계 건조에 증발. </li><li> 각 유리병에,, 100 μL 복구 표준 N-methylglucamine (물 1 MG ML -1)과 1 ML H 2 O를 추가 -20시 유리병의 parafilm와 입을, 동결 ° C를 포함, parafilm을 구멍이 후 건조 동결 . </li><li> 표준을 만들기 : 100 μL muramic 산성 (메탄올의 0.5 MG ML -1), 100 μL 글루코사민 (물 1 MG ML -1), 100 μL myo - 이노시톨 (물 1 MG ML -1), 100 μL N을 추가 methylglucamine (물 1 MG ML -1), 1 ML H 2 O, parafilm 각 유리병, -20 ° C에서 꼼짝 다음, 동결 건조, parafilm을 구멍. </li></ol> 3. Derivati​​zation <ol><li> 32 MG ML -1 히드록 실 아민 하이드로 클로라이드 40 밀리그램 ML -1 4 - 디메틸 아미노 - 평을 포함 derivatization 시약을 준비한다의 ridine 피리딘 - 메탄올 (4시 1분 V / V). </li><li> 단단히 모자, 그리고 철저하게 와동, reactivials 각 derivati​​zation 시약 300 μL를 추가합니다. </li><li> 35분에 대해 75-80 ° C의 물 목욕 (물론 어떤 물이 튜브를 입력할 수 있도록 피하기 위해 튜브를 봉인)에 튜브를 넣고. </li><li> 물 목욕 및 실내 온도에 시원한에서 튜브를 제거합니다. </li><li> 3 ML의 reactivials, 단단히 캡, 그리고 철저히 와동 각 1 ML 아세트산 무수물를 추가한 후 75-80 25분 대한 ° C 물 목욕으로 재가열. </li><li> 물 목욕 및 실내 온도에 시원한에서 튜브를 제거합니다. </li></ol> 4. 분리 및 측정 <ol><li> 각 유리병, 단단히 캡, 그리고 철저하게 소용돌이에 1.5 ML의 dichloromethane을 추가합니다. </li><li> 솔루션은 두 개의 구문을 별도 때까지 그대로 앉아있을 수 있도록 각 유리병, 단단히 뚜껑 철저히 와동 1 ML 1M HCL을 추가, 기음 1000 μL pipettor를 사용하여 상위 (수성) 단계를 버리고. </li><li> 같은 F에서ashion, 유기농 단계 3 번씩를 추출하지만, 한 ML H 2 O와 (마지막 세척 단계와 수성 상위 단계의 모든이 제거되었음을 보장하기 위해 특별한 처리). </li><li> 45 RapidVap를 사용하여 최종 솔루션을 건조 ° C (또는 건조한 원하는 경우 질소 가스를 사용하여). </li><li> 300 μL 아세트산 에틸 헥산 (1:1 V / V) 및 소형 볼륨 넣고 단단히 뚜껑 2 개 ML 호박 나사 캡 튜브에 이송에 디졸브. </li><li> ; 고정 위상 5퍼센트 페닐 - 95 % 메틸 polysiloxane (DB-5 또는 동급) 수소와 30m 길이, 0.25 밀리미터 ID, 0.25 음 필름 두께 : 부량 들어, 융합된 실리카 무극 성 모세관 컬럼을 사용하여 GC-FID로 분석 또는 헬륨 캐리어 가스와 같은, 0.5 ML 분 -1 일정한 흐름에서. 크로마 토그래피는 프리미엄 &quot;불활성&quot;단계와 수소 캐리어 가스에 좋다지만,보다 일반적인 종류와 헬륨으로 허용됩니다. 감지기 설정은 300입니다 ° C, 400 ML 분 -1 공기 30 ML 분 -1 질소 및 모두수소 화장 가스. 사출 및 오븐 매개 변수는 다음과 같습니다 ° C ~ 250으로 설정 GC 입구 1 개 μL 분할 주입 (30:1), 초기 오븐 온도 120 ° C, 1 분 개최, 10 오븐 온도를 증가 ° C 분. -1 250 ° C, 2.5 분, 잡아;. 270까지 진입로 ° C ~ 20 ° C 분 -1, 2 분 개최, 290까지 진입로 ° C ~ 20 ° C 분 -1, 5 분 누르고 있습니다. 캐리어 가스 유량을 조절하므로 250 ° C에서 이노시톨, 글루코사민과 muramic 산 유도체 elute, 270에서 N-methylglucamine elutes ° C. </li></ol> 5. 파생 검증 <ol><li> 분자 이온을 파악하고 유도체의 분자량을 결정하는 소프트 이온화 LC-ESI-TOF-MS를 사용합니다. </li><li> 파생의 대상 이온을 조사하기 위해 감도 향상을위한 GC-EI-MS-SIM 또는 GC-EI-MSMS을 사용하십시오. </li><li> 파생 상품의 준비에 대해 여러 isotopically 라벨이 시약을 사용하고 대량 시프트를 사용하여MS의 이러한 isotopically 표시된 파생 상품의 분자 이온과 이온 조각을 조사합니다. </li></ol> 6. 대표 결과 방식의 프로토콜은 주로 4 단계를 구성되어 산성 소화, 샘플 정제, derivatization 및 GC 결정 (그림 1). 글루코사민 및 표준 주식과 토양 샘플에서 muramic 산성에 대한 분석의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 글루코사민과 muramic 산, mannosamine 및 galactosamine (글루코사민의 두 isomers) 이외에도 메소드를 사용하여 동시에 확인할 수 있습니다. 내부 표준 myo - 이노시톨과 관련한 표준의 반응 요인에 따라 토양 샘플에서 이러한 생체를 정할 수 있습니다. 복구 기준은 질적 derivati​​zation 과정을 모니터링하는 데 사용되었습니다. aldononitrile 아세트산 derivatized 글루코사민과 muramic 산성 형성을위한 구조는 그림 3에 표시됩니다 </strong&gt;. 파생 상품의 제안된 구조는 감도 향상, 또는 소프트 이온화 LC-ESI-TOF-MS 8시 GC-기독교-SIM에 의해 결정되었다; 전자 이온화 따라 형성된 이온 조각 제안된 구조의 이온 스펙트럼을 비교하여 연구되었다 샘플은 다양한 동위 원소의 incorporations 11으로 준비했습니다. 그림 4는 지배적인 이온의 질량 변화를 보여주는 비 라벨 대리인, D-아세트산 경석고 및 U -13 C, 글루코사민 사용한 세 개의 시나리오에서 aldononitrile 아세테이트 derivatized 글루코사민의 M / Z 187.에게 기타 자세한 정보 및 설명은 우리의 최근 출판물 8, 11 참조된 수 있습니다. 이 전략은 파생 화학을 연구하는 모델이 될 수 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig1.jpg" /> 글루코사민의 분석 및 토양의 muramic 산성에 대한 프로토콜의 그림 1. 측정 플로우 차트샘플. 산성 소화, 정화, Derivati​​zation 및 GC 결정 : 프로토콜은 주로 4 단계가 포함되어 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig2.jpg" /> 그림 2. 표준 및 토양에 대한 이노시톨, 글루코사민, muramic 산, mannosamine, galactosamine 및 methylglucamine의 aldononitrile의 acetates의 GC-FID chromatograms. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig3.jpg" /> 그림 3. aldononitrile 아세트산 derivatized 글루코사민과 muramic 산성의 형성 구성표. 숫자 1은 nitrile 반응을 나타냅니다. 숫자 2는 아세틸화를 나타냅니다. <a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/3767/3767fig4_lg.jpg"><img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3767/3767fig4.jpg" /></a> 그림 4. 지배 이온 structur와 관련된 aldononitrile 아세테이트 derivatized 글루코사민의 질량 스펙트럼EI 모드 하에서 네;은 ()가 아닌 라벨이 대리인으로 준비, (B) D-아세트산 경석고, (C) U -13 C-글루코사민. 스타가 무거운 동위 원소 원자 또는 동위 원소 그룹을 나타냅니다.

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	<li>Zelles, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+patterns+of+phospholipids+and+lipopolysaccharides+in+the+characterisation+of+microbial+communities+in+soil:+a+review.">Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review.</a> Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).</li><li>Kirk, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+studying+soil+microbial+diversity.">Methods of studying soil microbial diversity.</a> Journal of Microbiological Methods. 58, 169-188 (2004).</li><li>Joergensen, R. G., Emmerling, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+evaluating+human+impact+on+soil+microorganisms+based+on+their+activity,+biomass,+and+diversity+in+agricultural+soils.">Methods for evaluating human impact on soil microorganisms based on their activity, biomass, and diversity in agricultural soils.</a> Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 169, 295-309 (2006).</li><li>Guggenberger, G., Frey, S. D., Six, J., Paustian, K., Elliott, E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+and+fungal+cell-wall+residues+in+conventional+and+no-tillage+agroecosystems.">Bacterial and fungal cell-wall residues in conventional and no-tillage agroecosystems.</a> Soil Science Society of America Journal. 63, 1188-1198 (1999).</li><li>Amelung, W., Lal, R., Kimble, J. M., Follett, R. F., Stewart, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Assessment Methods for Soil Carbon. , 233-270 (2001).</li><li>Guerrant, G. O., Moss, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+monosaccharides+as+aldononitrile,+O-methyloxime,+alditol,+and+cyclitol+acetate+derivatives+by+gas-chromatography.">Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas-chromatography.</a> Analytical Chemistry. 56, 633-638 (1984).</li><li>Zhang, X., Amelung, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gas+chromatographic+determination+of+muramic+acid,+glucosamine,+mannosamine,+and+galactosamine+in+soils.">Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine, mannosamine, and galactosamine in soils.</a> Soil Biology and Biochemistry. 28, 1201-1206 (1996).</li><li>Liang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+molecular+ion+structure+for+aldononitrile+acetate+derivatized+muramic+acid.">Investigation of the molecular ion structure for aldononitrile acetate derivatized muramic acid.</a> Journal of Microbiological Methods. 86, 224-230 (2011).</li><li>He, H., Xie, H., Zhang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+GC/MS+technique+to+assess+15N+and+13C+incorporation+into+soil+amino+sugars.">A novel GC/MS technique to assess 15N and 13C incorporation into soil amino sugars.</a> Soil Biology and Biochemistry. 38, 1083-1091 (2006).</li><li>Glaser, B., Gross, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compound-specific+delta+13C+analysis+of+individual+amino+sugars+-+a+tool+to+quantify+timing+and+amount+of+soil+microbial+residue+stabilization.">Compound-specific delta 13C analysis of individual amino sugars - a tool to quantify timing and amount of soil microbial residue stabilization.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 19, 1409-1416 (2005).</li><li>Liang, C., Balser, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometric+characterization+of+amino+sugar+aldononitrile+acetate+derivatives+used+for+isotope+enrichment+assessment+of+microbial+residues.">Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues.</a> Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).</li><li>Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminoglycoside+antibiotics+may+interfere+with+microbial+amino+sugar+analysis.">Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis.</a> Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).</li></ol>

우리는 공개 할게 없다.

aldononitrile 아세트산 derivati​​zed 글루코사민과 muramic 산성의 분석을 위해 제시 GC 기반 방식은 토양에서 추출한 이러한 아미노산 설탕을 계량하기 위해 비교적 빠른 방법을 제공합니다. 파생 상품은 화학적으로 안정, 한 분석에서 확인할 수 있습니다. 방법은 토양 샘플에 국한되지 않고, 비 토양 매트릭스에서 샘플에 대해 간단하게 할 수 있습니다. 이 방법에 사용되는 진공 ...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> Muramic 산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M2503-25MG </td></tr><tr><td> D-(+)-글루코사민 염산염 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> G1514-100G </td></tr><tr><td> N-메틸-D-glucamine </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> M2004-500G </td></tr><tr><td> Myo - 이노시톨 </td><td> 피셔 과학 </td><td> A307003G025 </td></tr><tr><td> 메탄올 (건조) </td><td> Acros의 유기물 </td><td> AC3269500​​10 </td></tr><tr><td> 4 - 디메틸 아미노 - 피리딘 </td><td> Acros의 유기물 </td><td> AC148270050 </td></tr><tr><td> 에틸 아세테이트 </td><td> VWR 인터내셔널 </td><td> BJGC100-4 </td></tr><tr><td> Hydroxlamine 하이드로 클로라이드 </td><td> 피셔 과학 </td><td> H330-100 </td></tr><tr><td> 피리딘 </td><td> 피셔 과학 </td><td> P368-500 </td></tr><tr><td> 아세트산 무수물 </td> &lt;TD&gt; 피셔 과학 </td><td> A10-100 </td></tr><tr><td> Dichloromethane (메틸렌 클로라이드) </td><td> 피셔 과학 </td><td> D37-500 </td></tr><tr><td> 헥산 </td><td> 피셔 과학 </td><td> H303-4 </td></tr><tr><td> 염산의 산성 (6M) </td><td> 피셔 과학 </td><td> S456-4 </td></tr><tr><td> 히드록 실 아민 하이드로 클로라이드 -15 N </td><td> 아이콘 서비스 </td><td> IN5280 </td></tr><tr><td> 아세트산 무수물 -2 H (D 6 C 4 O 3) </td><td> Acros의 유기물 </td><td> AC174670050 </td></tr><tr><td> D-글루코오스-U -13 C </td><td> 캠브리지 동위 원소 연구실 </td><td> CLM-1396-1 </td></tr><tr><td> 암모늄 sufate -15 N </td><td> 캠브리지 동위 원소 연구실 </td><td> NLM-713-1 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 유형 </td></tr><tr><td> 급속 Vap </td&gt; <td> LabConco </td><td> 790,002 </td></tr><tr><td> Vacum 펌프 </td><td> KNF Neuberger </td><td> D-79112 </td></tr><tr><td> 가수 분해 플라스크 </td><td> 피셔 과학 </td><td> 06 423A </td></tr><tr><td> Derivati​​zation의 microvial </td><td> 피셔 과학 </td><td> 06-100E </td></tr><tr><td> GC </td><td> 휴렛 팩커드 </td><td> 6890 </td></tr><tr><td> MS </td><td> 휴렛 팩커드 </td><td> 5972 </td></tr><tr><td> LC-ESI-TOF-MS </td><td> 애질런트 </td><td> 애질런트 1200 시리즈 HPLC 시스템은 애질런트 LC / MSD-TOF로 결합 </td></tr></tbody></table>

gc-based detection of aldononitrile acetate derivatized glucosamine and muramic acid for microbial residue determination in soil

특성화 미생물에 대한 양적 접근 방식은 생태계 내에서 미생물의 상태와 기능의 폭넓은 이해를위한 열쇠입니다. 미생물 분석을 위해 현재의 전략은 전통적인 실험실 문화에 종속적인 기술과 직접 추출 및 특정 생체 1, 2의 결정을 바탕으로 이들을 모두 포함합니다. 흙을 거주 미생물 종의 다양성 가운데 몇몇은 배양해 때문에 문화 종속적인 방법은 상당한 편견, biomarker 분석의 부재 제한을 소개합니다. 글루코사민, mannosamine, galactosamine 및 muramic 산성이 잘 토양 시스템 3의 가장 중요한 성분은 이러한 글루코사민 (가장 풍부)와 muramic 산성 (고유 세균 세포에서)으로 인해 생활과 죽은 미생물의 질량 모두 대책을 역임했습니다 4. 그러나 분석에 대한 지식의 부족은 과학적인 또래 간의 폭넓은 보급을 제한합니다. 모든 exi 중에서aldononitrile로 derivatization를 분석 방법을 아프게하는 것은 GC 기반의 분석을 다음 acetates 최적의 정밀도를 균형에 관하여 좋은 옵션으로 떠오르고, 감도, 단순, 샘플 보관 5시 좋은 색층 분리, 안정성. 여기서는 aldononitrile의 acetates에 대한 그들의 변환 후 토양에서 글루코사민과 muramic 산성의 안정적이고 비교적 간단한 분석을 위해 상세한 프로토콜을 소개합니다. 프로토콜은 주로 4 단계를 구성되어 산성 소화, 샘플 정제, derivati​​zation 및 GC 결정합니다. 단계별 절차는 옛 간행물 6, 7에 따라 수정됩니다. 또한 구조적으로 전자 이온화에 따라 형성 유도체와 그 이온 조각의 분자 이온의 유효성을 검사하기위한 전략을 제시한다. 우리는 aldononitrile 아세테이트 derivati​​zed 글루코사민과 mur의 분자량을 결정하기 위해 GC-EI-MS-SIM, LC-ESI-TOF-MS 및 isotopically 분류된 시약을 적용amic 산은, 우리는 각 파생 상품 8 이온 조각을 조사하기 위해 이온 스펙트럼에서 동위 원소 라벨이 표시된 파생 상품의 대량 교대를 사용했습니다. 이론적 해설과 더불어, 파생 및 이온 조각의 분자 이온의 유효성 검사 δ 13 C 또는 biogeochemical 연구 9, 10에서 이러한 생체 이온 조각을 사용하여 연구자에게 도움이 될 것입니다.

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GC-based Detection of Aldononitrile Acetate Derivatized Glucosamine and Muramic Acid for Microbial Residue Determination in Soil

우리는 글루코사민과 흙에서 추출한 muramic 산성의 aldonitrile 아세트산 유도체의 GC-기반의 분석을위한 메소드 프로토콜을 설명합니다. 화학적 메커니즘의 해설 들어, 우리는 또한 유도체와 전자 이온화 따라 형성된 이온 조각의 구조를 확인하기위한 전략을 제시한다.

토양에 미생물 잔류 결정을위한 Aldononitrile 아세트산 Derivati​​zed 글루코사민과 Muramic 산성의 GC 기반 탐지

Quantitative approaches to characterizing microorganisms are crucial for a broader understanding of the microbial status and function within ecosystems. ...

gc-based-detection-aldononitrile-acetate-derivatized-glucosamine

Research

JoVE Journal

Biology

16.8K 조회수.  University of Wisconsin, Madison. 우리는 글루코사민과 흙에서 추출한 muramic 산성의 aldonitrile 아세트산 유도체의 GC-기반의 분석을위한 메소드 프로토콜을 설명합니다. 화학적 메커니즘의 해설 들어, 우리는 또한 유도체와 전자 이온화 따라 형성된 이온 조각의 구조를 확인하기위한 전략을 제시한다.

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Microbial Communities in Nature and Laboratory - Interview

자연과 실험실에서 미생물 커뮤니티 - 인터뷰

연구

생물학

Direct Detection of the Acetate-forming Activity  of the Enzyme Acetate Kinase

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of acetate to acetyl phosphate utilizing ATP as a substrate. Acetate kinases are ubiquitous in the Bacteria, found in one genus of Archaea, and are also present in microbes of the Eukarya6. The most well characterized acetate kinase is that from the methane-producing archaeon Methanosarcina thermophila7-14. An acetate kinase which can only utilize PPi but not ATP in the acetyl phosphate-forming direction has been isolated from Entamoeba histolytica, the causative agent of amoebic dysentery, and has thus far only been found in this genus15,16.
In the direction of acetyl phosphate formation, acetate kinase activity is typically measured using the hydroxamate assay, first described by Lipmann17-20, a coupled assay in which conversion of ATP to ADP is coupled to oxidation of NADH to NAD+ by the enzymes pyruvate kinase and lactate dehydrogenase21,22, or an assay measuring release of inorganic phosphate after reaction of the acetyl phosphate product with hydroxylamine23. Activity in the opposite, acetate-forming direction is measured by coupling ATP formation from ADP to the reduction of NADP+ to NADPH by the enzymes hexokinase and glucose 6-phosphate dehydrogenase24.
Here we describe a method for the detection of acetate kinase activity in the direction of acetate formation that does not require coupling enzymes, but is instead based on direct determination of acetyl phosphate consumption. After the enzymatic reaction, remaining acetyl phosphate is converted to a ferric hydroxamate complex that can be measured spectrophotometrically, as for the hydroxamate assay. Thus, unlike the standard coupled assay for this direction that is dependent on the production of ATP from ADP, this direct assay can be used for acetate kinases that produce ATP or PPi.

A method for the determination of acetate kinase activity is described. This assay utilizes a direct reaction for determining enzyme activity and kinetics of acetate kinase in the acetate-forming direction with different phosphoryl acceptors. Furthermore, this method can be utilized for assaying other acetyl phosphate or acetyl-CoA utilizing enzymes.

효소 아세테이트 키나제의 아세테이트 - 형성 활동의 직접적인 탐지

Acetate kinase, a member of the acetate and sugar kinase-Hsp70-actin (ASKHA) enzyme superfamily1-5, is responsible for the reversible phosphorylation of ...

The Use of Chemostats in Microbial Systems Biology

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated including macromolecular synthesis, metabolism and ultimately, commitment to the cell division cycle. The chemostat, a method of experimentally controlling cell growth rate, provides a powerful means of systematically studying how growth rate impacts cellular processes - including gene expression and metabolism - and the regulatory networks that control the rate of cell growth. When maintained for hundreds of generations chemostats can be used to study adaptive evolution of microbes in environmental conditions that limit cell growth. We describe the principle of chemostat cultures, demonstrate their operation and provide examples of their various applications. Following a period of disuse after their introduction in the middle of the twentieth century, the convergence of genome-scale methodologies with a renewed interest in the regulation of cell growth and the molecular basis of adaptive evolution is stimulating a renaissance in the use of chemostats in biological research.

Cell growth rate is a regulated process and a primary determinant of cell physiology. Continuous culturing using chemostats enables extrinsic control of cell growth rate by nutrient limitation facilitating the study of molecular networks that control cell growth and how those networks evolve to optimize cell growth.

미생물 시스템 생물학의 Chemostats의 사용

Cells regulate their rate of growth in response to signals from the external world. As the cell grows, diverse cellular processes must be coordinated ...

Isolation of Native Soil Microorganisms with Potential for Breaking Down Biodegradable Plastic Mulch Films Used in Agriculture

Fungi native to agricultural soils that colonized commercially available biodegradable mulch (BDM) films were isolated and assessed for potential to degrade plastics. Typically, when formulations of plastics are known and a source of the feedstock is available, powdered plastic can be suspended in agar-based media and degradation determined by visualization of clearing zones. However, this approach poorly mimics in situ degradation of BDMs. First, BDMs are not dispersed as small particles throughout the soil matrix. Secondly, BDMs are not sold commercially as pure polymers, but rather as films containing additives (e.g. fillers, plasticizers and dyes) that may affect microbial growth. The procedures described herein were used for isolates acquired from soil-buried mulch films. Fungal isolates acquired from excavated BDMs were tested individually for growth on pieces of new, disinfested BDMs laid atop defined medium containing no carbon source except agar. Isolates that grew on BDMs were further tested in liquid medium where BDMs were the sole added carbon source. After approximately ten weeks, fungal colonization and BDM degradation were assessed by scanning electron microscopy. Isolates were identified via analysis of ribosomal RNA gene sequences. This report describes methods for fungal isolation, but bacteria also were isolated using these methods by substituting media appropriate for bacteria. Our methodology should prove useful for studies investigating breakdown of intact plastic films or products for which plastic feedstocks are either unknown or not available. However our approach does not provide a quantitative method for comparing rates of BDM degradation.

Plastic films labeled "biodegradable" are commercially available for agricultural use as mulches. Tillage represents an attractive disposal method, but degradation under field conditions is poorly understood. The purpose of this study was to develop methods for isolating native soil fungi and bacteria that colonize plastic mulch films after field burial.

생분해 성 플라스틱 뿌리 덮개 필름을 부셔 가능성이있는 기본 토양 미생물의 분리가 농업에 사용

Fungi native to agricultural soils that colonized commercially available biodegradable mulch (BDM) films were isolated and assessed for potential to ...

Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. The advantages of pyrosequencing for microbiology applications include rapid and reliable high-throughput screening and accurate identification of microbes and microbial genome mutations. Pyrosequencing involves sequencing of DNA by synthesizing the complementary strand a single base at a time, while determining the specific nucleotide being incorporated during the synthesis reaction. The reaction occurs on immobilized single stranded template DNA where the four deoxyribonucleotides (dNTP) are added sequentially and the unincorporated dNTPs are enzymatically degraded before addition of the next dNTP to the synthesis reaction. Detection of the specific base incorporated into the template is monitored by generation of chemiluminescent signals. The order of dNTPs that produce the chemiluminescent signals determines the DNA sequence of the template. The real-time sequencing capability of pyrosequencing technology enables rapid microbial identification in a single assay. In addition, the pyrosequencing instrument, can analyze the full genetic diversity of anti-microbial drug resistance, including typing of SNPs, point mutations, insertions, and deletions, as well as quantification of multiple gene copies that may occur in some anti-microbial resistance patterns.

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate bacterial strains, and detect genetic mutations that confer resistance to anti-microbial agents. In this video, the procedure for microbial amplicon generation, amplicon pyrosequencing, and DNA sequence analysis will be demonstrated.

미생물 식별 및 특성화를위한 Pyrosequencing

Pyrosequencing is a versatile technique that facilitates microbial genome sequencing that can be used to identify bacterial species, discriminate ...

Determination of Fatty Acid Oxidation and Lipogenesis in Mouse Primary Hepatocytes

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid oxidation, or alternatively, synthesize new lipid via de novo lipogenesis. The net sum of these pathways is dictated by a number of factors, which in certain disease states leads to fatty liver disease. Excess hepatic lipid accumulation is associated with whole body insulin resistance and coronary heart disease. Tools to study lipid metabolism in hepatocytes are useful to understand the role of hepatic lipid metabolism in certain metabolic disorders.
In the liver, hepatocytes regulate the breakdown and synthesis of fatty acids via &#946;-fatty oxidation and de novo lipogenesis, respectively. Quantifying metabolism in these pathways provides insight into hepatic lipid handling. Unlike in vitro quantification, using primary hepatocytes, making measurements in vivo is technically challenging and resource intensive. Hence, quantifying &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis in cultured mouse hepatocytes provides a straight forward method to assess hepatocyte lipid handling. 
Here we describe a method for the isolation of primary mouse hepatocytes, and we demonstrate quantification of &#946;-fatty acid oxidation and de novo lipogenesis, using radiolabeled substrates.

De novo lipogenesis and &#946;-fatty acid oxidation constitute key metabolic pathways in hepatocyte, pathways that are perturbed in several metabolic disorders, including fatty liver disease. Here we demonstrate isolation of mouse primary hepatocytes and describe quantification of &#946;-fatty acid oxidation and lipogenesis.

마우스 차 간세포에서 지방산 산화 및 지방 생성의 결정

Lipid metabolism in liver is complex. In addition to importing and exporting lipid via lipoproteins, hepatocytes can oxidize lipid via fatty acid ...

Isolation of Specific Genomic Regions and Identification of Associated Molecules by enChIP

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. To enable the non-biased identification of molecules interacting with a specific genomic region of interest, we recently developed the engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin immunoprecipitation (enChIP) technique. Here, we describe how to use enChIP to isolate specific genomic regions and identify the associated proteins and RNAs. First, a genomic region of interest is tagged with a transcription activator-like (TAL) protein or a clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) complex consisting of a catalytically inactive form of Cas9 and a guide RNA. Subsequently, the chromatin is crosslinked and fragmented by sonication. The tagged locus is then immunoprecipitated and the crosslinking is reversed. Finally, the proteins or RNAs that are associated with the isolated chromatin are subjected to mass spectrometric or RNA sequencing analyses, respectively. This approach allows the successful identification of proteins and RNAs associated with a genomic region of interest.

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the functions of these regions. This protocol describes procedures to perform engineered DNA-binding molecule-mediated chromatin imunoprecipitation (enChIP) for identification of proteins and RNAs associated with a specific genomic region.

특정 게놈 지역과 enChIP으로 관련 분자의 식별의 분리

The identification of molecules associated with specific genomic regions of interest is required to understand the mechanisms of regulation of the ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

격리 된 작업 쥐의 심장에서 포도당과 지방산 산화의 가격의 결정 방법

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against soilborne fungus Rhizoctonia solani. R. solani is a pathogen of a wide range of plant hosts worldwide. The fungus survives in soils as a saprophyte and grows rapidly on simple water agar media. The plate assay is a rapid method to compare composts for their ability to slow the growth of R. solani. The assay also correlates well with suppression of other soilborne fungal pathogens that survive as saprophytes in soils such as Alternaria early blights, Fusarium wilt, Phytophthora root rot, and Pythium root rot.

Presented is a protocol for a plate competition assay to identify whether a specific compost is likely to contain bacteria and fungi that suppress growth of Rhizoctonia solani.

질병 억제의 빠른 예비 평가로 격판덮개 경쟁 분석 결과

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

Laser-Capture Microdissection RNA-Sequencing for Spatial and Temporal Tissue-Specific Gene Expression Analysis in Plants

The development of a complex multicellular organism is governed by distinct cell types that have different transcriptional profiles. To identify transcriptional regulatory networks that govern developmental processes it is necessary to measure the spatial and temporal gene expression profiles of these individual cell types. Therefore, insight into the spatio-temporal control of gene expression is essential to gain understanding of how biological and developmental processes are regulated. Here, we describe a laser-capture microdissection (LCM) method to isolate small number of cells from three barley embryo organs over a time-course during germination followed by transcript profiling. The method consists of tissue fixation, tissue processing, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction followed by real-time PCR or RNA-seq. This method has enabled us to obtain spatial and temporal profiles of seed organ transcriptomes from varying numbers of cells (tens to hundreds), providing much greater tissue-specificity than typical bulk-tissue analyses. From these data we were able to define and compare transcriptional regulatory networks as well as predict candidate regulatory transcription factors for individual tissues. The method should be applicable to other plant tissues with minimal optimization.

Presented here is a protocol for laser-capture microdissection (LCM) of plant tissues. LCM is a microscopic technique for isolating areas of tissue in a contamination-free manner. The procedure includes tissue fixation, paraffin embedding, sectioning, LCM and RNA extraction. RNA is used in the downstream tissue-specific, temporally resolved analysis of transcriptomes.

토양에 미생물 잔류 결정을위한 Aldononitrile 아세트산 Derivati​​zed 글루코사민과 Muramic 산성의 GC 기반 탐지

토양에 미생물 잔류 결정을위한 Aldononitrile 아세트산 Derivatized 글루코사민과 Muramic 산성의 GC 기반 탐지