이 프로토콜은 소량의 생물학적 물질을 사용하여 이해 분야의 특정 세포로부터 공간 및 측두전사를 얻기 위해 RNA-시퀀싱과 결합된 레이저 포획 미세 절위를 사용합니다. 레이저 기술의 주요 장점은 정상적인 조직 컨텍스트 내에서 세포의 직접 시각화를 용이하게하여 이산 세포가 접촉없는 방식으로 정확하게 분리 될 수 있다는 것입니다. 이 프로토콜은 식물 세포의 격리에 최적화되어 있지만, 그것은 stologically 식별 될 수있는 대부분의 세포에 적용 할 수있다.
좋은 샘플 준비는 중요합니다. 따라서, 이 기술을 처음으로 수행하는 사람은, 조직 고정 및 포함의 소품 최적화는 레이저 캡처 마이크로절 전에 중요하다. 조직 샘플을 수집하기 전에, 수확할 종 및 조직 유형에 적합한 고정을 준비한다.
보리 씨앗의 경우, 시료를 얼음 냉간 고정물의 최소 10X 부피로 잠기 전에 종자 샘플을 반으로 자른다. 진공 침투를 사용하여 고정물의 침투를 가속화하십시오. 조직은 침투의 끝에 의해 침몰해야, 다음 하룻밤 잠복에 대한 고정을 새로 고침하고 조직 처리를위한 카세트로 샘플을 전송.
자동 프로세서의 금속 바구니에 적재된 카세트를 배치하고 금속 바구니를 챔버 1 위의 홀더에 부착합니다. 티슈 프로세서의 제어판에 프로그램을 설정하고 자동 처리 프로그램을 시작하기 시작 프레스. 시스템은 카세트를 에탄올의 그라데이션 시리즈로 찍어 서 샘플을 농도당 90분 동안 탈수합니다.
마지막 에탄올 침수 후, 시스템은 표시된 대로 솔루션당 90분 동안 자일렌 그라데이션에 샘플을 담급합니다. 그 다음에 는 55~60°C의 용융 파라핀에 290분이 침수되었습니다. 다음 날 아침, 티슈 프로세서에서 파라핀 침투 카세트를 제거하고 파라핀 포함으로 진행한다.
다음 날 아침, 미세 한 집게를 사용하여 공정 샘플을 적절하게 크기의 금형으로 옮기고 각 샘플에 용융 파라핀을 추가하십시오. 보리 씨앗의 경우 파라핀의 샘플을 세로방향으로 방향을 지정하여 종방향 섹션의 획득을 용이하게 합니다. 깨끗한 카세트를 금형에 놓고 전체 카세트가 충분한 양의 파라핀으로 완전히 덮여 있는지 확인하여 샘플을 카세트에 고정시하십시오.
그런 다음 금형에서 블록을 해제하기 전에 파라핀이 설정 될 때까지 10 ~ 20 분 동안 콜드 플레이트에 금형을 놓습니다. PEN 멤브레인 슬라이드를 준비하려면 RNS 비활성화 솔루션에 슬라이드를 3초 동안 잠근 다음 두 개의 간단한 세차및 DEPC 처리 된 물을 넣습니다. 그런 다음 370섭씨 인큐베이터에서 슬라이드를 운전하여 남은 용액을 제거하고 UV는 헤이즐넛이 아닌 파라핀을 향상시키기 위해 30 분 동안 라미나르 흐름 캐비닛에서 슬라이드를 처리합니다.
샘플 조직 단면의 경우 파라핀 블록을 차가운 접시에 놓고 DEPC 처리 된 물로 수조를 채운 다음 섭씨 42도까지 따뜻하게하십시오. 관심 영역의 깊이로 블록을 잘라 내고 파라핀 블록을 6~10미크로 절개한다. 잘 단면된 블록은 블레이드 가장자리에 리본을 형성합니다.
미세 트위저를 사용하여 미세 한 트위저를 사용하여 미세 토메에서 수조로 리본을 부드럽게 옮기고 리본이 수면에 평평하게 놓여 있음을주의하십시오. 섹션을 수집하려면 슬라이드를 45도 각도로 잡고 위쪽으로 움직여 리본을 물 밖으로 밀어 내고 보풀이 없는 조직을 사용하여 여분의 물을 조심스럽게 제거합니다. 모든 구간을 모으면 자일렌에서 320초 세척한 후 100%에탄올로 230초 세척, 70%에탄올로 230초 세척합니다.
탈파라피네이션 및 건식 조직 섹션에서 관심 있는 세포를 미세하게 하기 위해 3개의 LCM 현미경 슬롯에 슬라이드를 적재하고 수집 튜브를 사용 가능한 슬롯에 적재합니다. 단계를 이동하여 절단해야 하는 샘플 영역을 찾고 멤브레인 슬라이드에서 조직이 없는 빈 세그먼트를 잘라냅니다. 절삭 속도와 레이저 압력의 절단을 최적화하려면 에너지와 초점을 발사합니다.
도면 도구를 사용하여 조직에 대한 관심 영역을 설명하고 최적화된 매개 변수와 Robo LPC 기능을 사용하여 세포를 접착제 캡으로 투석할 수 있습니다. 요소 목록에서 플래그를 선택하여 플래그 도구를 사용하여 관심 영역을 표시합니다. 캡 검사 버튼을 확인하여 접착제 캡을 검사하여 샘플이 캡처되었는지 확인합니다.
일반적으로 RNA 추출에 필요한 캡 당 10~ 15개의 섹션이 필요합니다. 모든 샘플을 획득한 직후RNA 분해를 피하기 위해 RNA 추출로 즉시 진행합니다. RNA 추출 및 RNA 증폭 후 자동화된 전기 포고시스템을 사용하며, 제조업체의 지시에 따라 안티센스 RNA를 정량화하고 자격을 갖추게 된다.
이 연구에서는, LCM, RNA-염기서열분석은 발아 도중 48시간 시간 과정을 통해 8시간마다 3개의 배아 기관에서 소수의 세포에 적용되었습니다. 관심 있는 조직이 선택한 영역의 가장자리를 태우지 않고 주변 조직에서 정밀하게 절단되고 빠질 수 있도록 절단 매개 변수를 올바르게 조정하는 것이 중요합니다. RNA 증폭 전에 총 RNA의 파급 효과는 양질의 RNA 샘플에서 18 및 28S 리보소말 하위 단위의 뚜렷한 전기 전구 대역 및 형광 피크의 검출을 허용합니다.
성공적으로 합성된 안티센스 RNA는 2차례의 증폭 후 약 300개의 뉴클레오티드를 가진 100~1000개의 뉴클레오티드에서 단변 대칭 크기 분포를 나타낸다. 발아의 48 시간 이상 다른 조직에서 발현 된 유전자의 다차원 스케일 플롯, 같은 시간 시점에서 샘플 사이 보다 단일 조직의 샘플 사이 더 큰 유사성을 보여줍니다., 하지만 다른 조직. 분화 유전자의 수는 조직의 0 시간 지점에 비해 각 조직에서 발아의 과정을 통해 점진적으로 증가.
이 대표적인 분석에서, 깃털의 25%, 방사형34%, 스커텔럼 의 41%가 각 조직 내에서 독점적으로 발현되는 것으로 나타났다. 선택한 영역의 가장자리를 태우지 않고 주변 조직에서 선택 영역의 정밀한 절제 및 탈취를 위해 절삭 파라미터를 올바르게 조정하는 것이 중요합니다. 개선된 크로마틴 및 단백질 정제 방법을 통해 질량 분광계 기구를 강화하여 LCM은 세포 유형별 특정 에피소드형 및 프로테오믹스 연구 임플란트에 사용할 수 있습니다.
