우리는 우수한 기술 지원을위한 마뉴 Budak, Ljiljana Marinkovi와 크리스티나 Wullimann 감사드립니다. 우리는 PLP-GFP 마우스를 제공하기 위해 W. 맥클린 감사드립니다. 알렉산더 - 폰 - 훔볼트 재단에 의해, 그리고 국가 기금 기관 ( &quot;Bundesministerium 모피 Bildung 숙녀 Forschung&quot;로, TM은 독일 Forschungsgemeinschaft (Sonderforschungsbereich SFB 596 DFG)의 고급 연구 연구소 (Technische Universität 뮌헨)에 의해 지원됩니다 ) ERA-NET 뉴런 &#39;iPSoALS &quot;와&quot;2 광자 이미징 &quot;의 프레임 인치 TM과 MB가 통합 단백질 과학 (뮌헨)의 센터에 의해 지원됩니다. PM은 Technische Universität 뮌헨 (죽을 차례-GS)의 대학원에 의해 지원되었다.

1. Triangularis Sterni Explant (그림 1) 시간 : 15 분. <ol><li> 포셉 2 켤레, 가위 1 쌍, 스프링 가위 1 쌍, 1 조직 문화 요리 (10 cm) : 수술기구를 준비합니다. (15 분에 대한 최소) 미리 부풀어 오른 냉각 (4 ° C) 5 % CO 2 / 95% O 2 벨소리의 솔루션입니다. 얼음 15 cm 조직 문화 접시를 작성하고 금속 플레이트로 다룹니다. 해부 현미경을 준비하고 해부하는 동안 explant을 냉각하기 위해 절개 범위에서 얼음을 15 cm 접시를 놓습니다. </li><li> Lethally isoflurane 과다 복용 (또는 희생의 다른 승인 된 방법)에 의해 마우스를 마취. explant 털의 오염을 방지하기 위해 70 % 에탄올로 마우스를 스프레이. SC는 표백을 위해, 우리는 축삭의 동시 시각화를 위해 Thy1 - OFP3 또는 Thy1 - Membow13에 발을 담그 할 수 있습니다 PLP-GFP 마우스를 사용했습니다. </li><li> 큰 가위의 쌍을 사용하여,의 중간 선 절개를가슴과 흉곽의 아래쪽 가장자리에 평행이 절개를 통해 피부. </li><li> 큰 가위의 쌍을 사용하여, 피부를 제거 복부 벽을 열고 척추 컬럼에 다시 먼길을 흉곽에 절개를 병렬합니다. 그런 다음 가슴의 근육 삽입에 가까운 절개를하여 가슴 근육을 해부. </li><li> 그냥 칼 모양의 연골 아래에 열려있는 가로막을 잘라과 늑골 삽입을 따라 횡경막을 해부. </li><li> 포셉의 집합으로 칼 돌기에 의해 갈비​​를 개최, 가까이의 삽입에 가능한 한, 척추 열에서 갈비뼈를 절단 시작합니다. 왼쪽 및 오른쪽 상처는 흉골 병 sterni에 대한 가슴 위에 수렴해야합니다. 주요 혈관을 (특히 빗장 밑 정맥) 절단 방지하기 위해보십시오. 더 나은 가시성을 집게로 칼 돌기에 누른 상태 부드럽게 준비를 리프팅에 의해 달성된다. </li><li> 단지 흉골 병 sterni 아래 가로 컷을및 냉각 5 % CO 2 / 95% O 2 - 부풀어 오른 벨소리의 솔루션을 10 cm 그릇에 explant를 전송합니다. 얼음 가득 15 cm 조직 배양 접시를 덮고있는 금속 판에 10 cm 접시를 놓습니다. 모든 자세한 단계는 해부 현미경 아래에서 수행해야합니다. </li><li> 작은 봄 가위를 사용하여 thymus, 늑막, 격막 (내부)과 가슴 근육의 나머지 제거 (외부, 그림 1B-D). </li><li> 3.5 cm 요리에 explant를 맞추려면 가슴에 삽입하지 않은 모든 갈비를 해부. 이것은 가장 작은 봄 가위를 사용하고 갈비 (그림 1E) 사이에있는 조직을 절단 이루어집니다. </li><li> minutien 핀을 (; 그림 1G &lt;4 mm까지 단축)를 사용하여 Sylgard 코팅 3.5 cm 조직 배양 접시에 triangularis sterni 신경 근육 explant를 핀. 두 핀은 흉골의 연골 성의 (흰색) 부분을 통과해야합니다. 두 번째의 왼쪽과 오른쪽에있는 갈비를 두 개 이상 핀을 삽입전자 explant은 부드러운 연골 성의 부품을 목표로하고 아래에있는 갈비뼈을 피하거나 triangularis 근육을 닫습니다. 더 핀이 사용하는, 더 나은 (우리가 일반적으로 8-10을 사용). 당신이 준비를 핀으로 약간 늘어 위치로 근육을 고정, 갈비뼈가 다소 전파되어 있는지 확인합니다. </li><li> 선택 사항 : 알렉사 염료 (5 % CO 2 / 95% O 2 - 부풀어 오른 벨소리의 솔루션에서 0.8 μg / ML의 농도)에 커플 링 bungarotoxin을 추가하여 아세틸 콜린 수용체를 포함하는 신경 사이트를 표시합니다. 실내 온도 15-20 분에 대한 Sylgard 코팅 접시에 고정 explant를 배양 한 다음 5 % CO 2 / 95% O 2 - 부풀어 오른 벨소리의 솔루션으로 여러 번 씻는다. </li></ol> 2. 표백 SCS 및 선택 시간 경과 현미경 (그림 2) 타이밍 : 30 - 45 분 + 옵션 1 - 시간 경과 5 시간. <ol><li> 공 촛점 현미경 시설 지혜로 전송 3.5 cm Sylgard - 코팅 접시를H 아르곤 레이저 (488 nm의 파장)와 물 침지 목표 (배속, 0.13 NA, 20x, 0.5 NA와 100x, 1.0 NA 또는 60x, 0.9 NA). </li><li> 시간 경과 현미경을위한 선택 사항 : 삽입 난방 링에 요리 3.5 cm Sylgard - 코팅, superfusion 시스템과 온도 프로브 (그림 2A)를 설치합니다. 그들 중 아무도 explant, 요리 나 Sylgard 코팅의 가장자리를 만지지 없는지 확인합니다. 33-35에 샘플을 가열 ° C. 세포가 표백 단계들 사이에서 덜 역학을 표시로 SC 시간이 경과하지 않고 표백를 들어, 방 온도는 더 나은 것입니다. </li><li> 4 배 공기 목적은 triangularis sterni 근육의 innervation 패턴을 관찰하고 triangularis sterni의 endplate 밴드를 찾아 함께. 20x 찍기 - 콘 목표로 전환하여 endplate 밴드 (지역에 놓인 갈비 좋은 후보입니다) 내 표면 지역을 찾고 시작합니다. 개인 NMJs에 확인 100x 또는 60x 찍기 - 콘 목표로 목표를 변경합니다. 이상적인는 여러 SCS이 적용되어 매우 superfic에 위치하고 있습니다 NMJ입니다ially (그림 2B). 당신은 표백 후 시간 경과 영상을 수행하는 경우, 상대적으로 수율을 높이기 위해 함께 가까운 거리에 있습니다 3 NMJs까지 선택합니다. </li><li> 사진 표백 개인 SCS (그림 2B) 전에 NMJ의 공 촛점 이미지를 취득. (올림푸스 FV1000 현미경에 예 전체 해상도 이미지의 경우 픽셀 당 ~ 0.1 μm의 나이 퀴 스트 (Nyquist) - 제한된 샘플링에 결과 100x, 1.0 NA 목표 및 2.5 줌을 사용합니다.) </li><li> &quot;공원&quot;중심에 오초 (또는 같은 올림푸스 현미경에서 &quot;토네이도 검색&quot;기능으로 사용할 수있는 관심의 작은 지역에서 효율적으로 스캔 패턴에 대한 최대 전력을 사용하여 SC의 핵심에있는 488 nm의 레이저 빔, 우리가 공 촛점 현미경을 사용으로, 레이저는 1.0 NA의 목적으로 488 나노 미터에서 따라서 이미지 켤레의 비행기에 초점을 맞춘되고, 직경 &lt;0.5 μm). 결과를 표백 셀 판사에 다시 초점을 맞 춥니 다. GFP 수준까지 다시 단계를 표백 필요한 반복 줄일 수있는 경우가까운 배경 수준으로 D. (그림 2C) 표백 후 이미지를 취득. 그것은 표백 지역 두 셀 사이에 중복되는 외부되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다 - 중복이있을 경우, 두 번째 셀에 표백하는 것은 분명합니다. </li><li> 하나를 제외한 모든 SC는 (그림 2D-E) 표백 될 때까지 위의 단계를 반복합니다. 마지막으로 &quot;표백하지 않은&quot;SC는 공 촛점 시간 경과 현미경에 적합합니다. 이미지의 뺄셈에 의해 하나의 세포를 재구성, 예를 들어 하나의 SC의 형태 및 지역 (그림 2 층)을 윤곽을 그리다하기 위해 포토샵 소프트웨어를 사용합니다. 이 마법사를 빼는 것은 소음 (포토샵의 연속 &quot;레이어&quot;에 가져 오기 한 후 채널 탭의 상단에있는 드롭 다운 메뉴에서 &quot;차이&quot;로 상위 채널을 설정하여 예를 들어) 추가에 유의해야합니다. 이것은 빼기 전에 채널에있는 &quot;despeckle&quot;기능을 사용하고 분명히에서 보낸 않는 배경을 멀리 자르기에 의해 피할 수표백 세포. 대비를 최적화하려면,이 &#39;수준&#39;창에서 두 개 채널의 밝기를 조정해야 할 수 있습니다. 표백 세포의 결과 이​​미지는 독특​​한 색조의 의사 색 시냅스의 원래 이미지에 겹쳐과 (모든 표백을 위해이 일을에서 원본 이미지의 표백 셀의 영역을 색상으로 투명 만들어 마지막 , 표백하지 않은 세포 그림 2 층 결과에 표시되는 이미지). </li><li> 선택 사항 : 하나를 제외한 모든 SCS를 표백 한 후 시작 공 촛점 시간 경과 현미경. 고정 간격 (예를 들어 모든 5-10 분)에 이미지를보세요. 가능한 한 작은 레이저 전원으로 사용합니다. 최대 3 NMJs은 같은 세션에서 이미징 할 수 있습니다. </li><li> 다음, 확대하지 않고 100x에서 20x 및 4X 목표를 (그림 2G-I)를 사용하여 지역의 이미지를 이미지를 활용하여 시간 실효 NMJs의지도를합니다. 이 &quot;지도&quot;는 고정 근육의 immunohistochemistry에 따라 NMJs을 찾기 위해 필요합니다. </li><li> 이미지처리, 최대 강도 계획에 개별 이미지 변환 및 TIFF 형식으로 저장합니다. 스택에 모든 Z-예상 시간 포인트를 결합하고 XY로 정렬 예 : (오픈 소스 소프트웨어 ImageJ에 따라 패키지, 보건 국립 연구소) 피지에서 &quot;stackreg&quot;플러그인 (10)을 사용. </li></ol> 3. 고정과 Immunohistochemistry (그림 3) 타이밍 : 숙박. <ol><li> 조심스럽게 핀을 제거하여 적어도 15 ML 4퍼센트 PFA를 포함하는 50 ML 반응 관에 explant를 전송합니다. 얼음에 1 시간 동안 triangularis sterni 근육을 포함하는 앞 가슴 벽을 게시 - 수정. 적어도 10 분 동안 PBS에 0.​​1 M 글리신 (잔류 정착액을 해소하고 따라서 배경을 줄이기 위해)로 고정 조직을 씻어. 샘플은이 시점에서 저장하고 나중에 처리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 0.01 M PBS로 가득 찬 10 cm Sylgard 코팅 조직 배양 접시에 고정 explant를 전송합니다. 일시와 사다리꼴 모양을 잘라가슴과 뼈 - 투 - 연골 전환을 통해 다른 사람에게 드 병렬 -이는 표면에 triangularis 근육이 포함되어 있습니다. 수평 (예 횡단 흉골) triangularis 근육의 꼬리 끝이 자유롭게 액세스 할 수 있도록 기준으로 낮은 갈비를 제거합니다 (그림 3A-D). </li><li> 사다리꼴의 위쪽 부분 (그림 3E)에 핀으로 피하 주사기 바늘을 삽입합니다. 부드럽게 근육의 꼬리 코너에 집중하고 마이크로 메스로 바늘을 사용하여 표면에 triangularis 근육을 제거하는 1 ML의 주사기와 포셉에 부착 된 피하 주사기 바늘을 사용합니다. 상처는 가슴 벽의 평면에 평행 한되어 있는지 확인합니다. 근육의 꼬리 부분이 출시되면, 가슴 벽을 통해 근육 아래 핀으로 다른 피하 주사기 바늘을 삽입 -이 준비를 움직이게하고 포셉 (그림 3 층)를 사용하여 근육에 부드러운 풀을 발휘 할 수 있습니다. 당신은 결합 tiss를 절단하기 때문에UE의 삽입, &quot;껍질&quot;떨어져 가슴의 근육. 봄 가위로 마지막 꼬리 첨부 파일을 자른다. 집게를 사용하여 지방과 혈액 혈관 유적을 제거합니다. . 라이브 및 고정 조직 작업을위한 도구와 요리 별도의 세트를 사용하여 신경을 멀리 추출하지 않습니다주의하십시오. </li><li> 실온에서 흔드는에서 1 시간에 차단 솔루션으로 조직 샘플을 전송하여 immunohistochemistry를 (표준 프로토콜을 사용하여)를 시작합니다. 착색에 대한 가능한 가장 작은 볼륨 96 - 웰 플레이트를 사용하여 200 μl입니다. </li><li> 4에 밤새 차단 솔루션, 잘 당 200 μl, ° 흔드는에서 C에 희석 주요 항체을 적용합니다. </li><li> 10 분에 0.01 M PBS 세 번에 씻으십시오. </li><li> 솔루션을 차단에 희석 실온에서 1-2 시간에 적합 차 항체을 적용합니다. </li><li> 10 분에 0.01 M PBS 세 번에 씻으십시오. </li><li> 반 변색 매체 (예 Vectashield)와 coverslip에 탑재합니다. </li><li> 자기 금속 접시에 장소 슬라이드, 상단에 장소 자석4 ° C.에서 몇 시간이나 야간에 평평하게 할 수있는 샘플의 매니큐어와 함께 밀봉합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, 41-51 (2000).</li><li>Mallon, B. S., Shick, H. E., Kidd, G. J., Macklin, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteolipid+promoter+activity+distinguishes+two+populations+of+NG2-positive+cells+throughout+neonatal+cortical+development.">Proteolipid promoter activity distinguishes two populations of NG2-positive cells throughout neonatal cortical development.</a> J. Neurosci. 22, 876-885 (2002).</li><li>Brill, M. S., Lichtman, J. W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Livet, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+strategies+for+combinatorial+expression+of+fluorescent+proteins+in+the+nervous+system.">Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system.</a> Nature. 450, 56-62 (2007).</li><li>Thompson, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+with+photoswitchable+GFP+in+Schwann+cells.">Transgenic mice with photoswitchable GFP in Schwann cells.</a> Society for Neuroscience. Program 241, (2008).</li><li>Williams, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+development+of+outer+retinal+synapses+in+the+absence+of+glial+contact.">In vivo development of outer retinal synapses in the absence of glial contact.</a> J. Neurosci. 30, 11951-11961 (2010).</li><li>Kerschensteiner, M., Reuter, M. S., Lichtman, J. 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W., Thompson, W., Zuo, Y., Misgeld, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+constraints+dictate+glial+territories+at+murine+neuromuscular+junctions.">Spatial constraints dictate glial territories at murine neuromuscular junctions.</a> The Journal of cell biology. 195, 293-305 (2011).</li><li>Zuo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+proteins+expressed+in+mouse+transgenic+lines+mark+subsets+of+glia,+neurons,+macrophages,+and+dendritic+cells+for+vital+examination.">Fluorescent proteins expressed in mouse transgenic lines mark subsets of glia, neurons, macrophages, and dendritic cells for vital examination.</a> J. Neurosci. 24, 10999-11009 (2004).</li></ol>

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

여기에 제시된 SC 표백 방법은 간단 신속하고 다양한입니다은 (i)는 하나의 transgene에 따라 공 촛점 현미경에 의해 단일 SC의 형태와 역학을 공개 가능 - 추가 대립 유전자를 필요로 질병 모델로 접근 예를 결합 할 때 상당한 장점 . 해부에서 고정으로 절반이 하루에 수행 할 수 있으므로 (ii) 본 방법은 빠른 것입니다. 이 같은 셀 ablations, 이미징 세포 소기관, 전기 생리학 또는 immunohistochemistry와...

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 (예) </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 (선택 사항) </td></tr><tr><td> 70 % (권 / 권) 에탄올 솔루션 </td><td> 로스 </td><td> T913.1 </td><td> 스프레이 병에 </td></tr><tr><td> isoflurane </td><td> Forene, 애보트 </td><td></td><td> 다른 승인 된 마취가 치명적인 마취 사용할 수 있습니다 </td></tr><tr><td> 유전자 변형 마우스 (PLP-GFP) </td><td></td><td></td><td> 인용 출처에서 획득 할 </td></tr><tr><td> 추위에 빛 조명과 해부 현미경 </td><td> 올림푸스 SZ51 </td><td></td><td> SCHOTT KL 1500 LCD가 장착 </td></tr><tr><td> 포셉 #이 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11233-20 </td><td></td></tr><tr><td> 포셉 # 5 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 11295-00 </td><td></td></tr><tr><td> 가위, 대형 의료 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 14108-09 </td><td></td></tr><tr><td> 가위, 작은 각진 봄 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 15033-09 </td><td></td></tr><tr><td> 인라인 (in-line) 히터 </td><td> 워너 악기 </td><td> SF-28 </td><td></td></tr><tr><td> 3.5 cm 요리에 링을 가열 </td><td> 워너 악기 </td><td> 64-0110 DH-35 </td><td></td></tr><tr><td> 이 채널 온도 제어 시스템 </td><td> 워너 악기 </td><td> TC-344B </td><td></td&gt; </tr><tr><td> superfusion 펌프 시스템 </td><td></td><td></td><td> 주문품의 </td></tr><tr><td> 15 cm 조직 문화 요리 </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1803.003 </td><td> 얼음 가득과 금속 플레이트에 의해 적용 </td></tr><tr><td> 10 cm 조직 문화 요리 </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802.003 </td><td> 산소 벨소리의 솔루션 </td></tr><tr><td> 3.5 cm 조직 문화 요리 </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1800.003 </td><td> Sylgard 폴리머로 가득 </td></tr><tr><td> Sylgard 폴리머 </td><td> 다우 코닝 </td><td> Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트 </td><td></td></tr><tr><td> 공 촛점 현미경 </td><td> 하늘 </td><td> FV1000 </td><td> 아르곤 레이저로 </td></tr><tr><td> 50 ML 반응 관 </td><td> Sarstedt </td><td> 62.547.254 PP </td><td></td></tr><tr><td> PBS의 4퍼센트 PFA </td><td> 시그마 </td><td> P6148 </td><td></td></tr><tr><td> 캐뉼라 0.5 mm X 25mm </td><td> Neolab </td><td> E-1510 </td><td></td></tr><tr><td> 주사기 1 ML </td><td> Neolab </td><td> E-1496 </td><td></td></tr><tr><td> synaptophysin 항체 </td><td> Invitrogen </td><td> 18-0130 </td><td> 토끼 </td></tr><tr><td> 이차 항체 </td><td> Invitrogen </td><td> A-11012 </td><td> 알렉사 594 </td></tr><tr><td> 24 잘 판 </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1836 </td><td></td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td> 시그마 </td><td> P4417 </td><td></td></tr><tr><td> PBS에 0.​​1 M 글리신 </td><td> 로스 </td><td> 3790.1 </td><td></td></tr><tr><td> coverslips </td><td> Neolab </td><td> E-4132 </td><td></td></tr><tr><td> 슬라이드 </td><td> Neolab </td><td> E-4121 </td><td></td></tr><tr><td> Vectashield </td><td> 벡터 실험실 </td><td> H-1000 </td><td></td></tr><tr><td> minutien 핀 × 10 </td><td> 정밀 과학 도구 </td><td> 26002-20 </td><td> &lt;4 mm까지 단축 </td></tr><tr><td> α-Bungarotoxin 알렉사 594에 커플 링 </td><td> Invitrogen (분자 프로브) </td><td> B-13423 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 솔루션을 차단 </td></tr><tr><td> 0.01 M PBS </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0.2 % 트리톤 - X100 </td><td> 로스 </td><td> 3051.3 </td><td></td></tr><tr><td> 10% 일반 염소 세럼 </td><td> Abcam </td><td> ab7481 </td><td></td></tr><tr><td> 1퍼센트 소 혈청 알부민 </td><td> 시그마 </td><td> A7030 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 종을 울리는 사람 95% O 5분의 2 %의 CO 2 부풀어 오른 </td></tr><tr><td> 125 MM NaCl </td><td> 시그마 </td><td> S7653 </td><td></td></tr><tr><td> 2.5 MM KCl </td><td> 시그마 </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> 1.25 MM 아뇨 2 PO 4 </td><td> 시그마 </td><td> S8282 </td><td></td></tr><tr><td> 26 MM NaHCO 3 </td><td> 시그마 </td><td> S6297 </td><td></td></tr><tr><td> 이 MM CaCl 2 </td><td> 시그마 </td><td> 21,114 </td><td></td></tr><tr><td> 1 ㎜ MgCl 2 </td><td> 시그마 </td><td> 63,020 </td><td></td></tr><tr><td> 20 MM 포도당 </td><td> 시그마 </td><td> G7528 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 1. 특정 시약 및 장비. </td></tr></tbody></table>

sequential photo-bleaching to delineate single schwann cells at the neuromuscular junction

사진 표백 순서는 NMJ에서 개인 SCS에 라벨을 할 수있는 비 침습적 방법을 제공합니다. NMJ는 포유류의 신경계의 가장 큰 시냅스이며, 시냅스 구조와 기능을 연구 모델을지도로 제공하고 있습니다. 마우스 NMJs 모터 축삭 터미널에서 근육 섬유와 꽈배기 같은 연락처 사이트 구성합니다. 모터 축삭과 터미널 SCS에 끼 우고 있습니다. 지난 수십 년 동안, 여러 가지 유전자 변형 생쥐는 각각 Thy1-XFP 1 PLP-GFP 마우스 2 예를 들어, 모터 뉴런과 SCS를 시각적으로 생성되었습니다. 모터 axons 함께 myelinating axonal SCS는 약진 액션 잠재적 인 전파를 사용하려면, Ranvier의 노드로 구분하여 겹치지 internodes에 배치된다. 대조적으로, 시냅스에서 터미널 SCS는 모니터링 및 neurotransmission를 홍보 파편과 가이드 재생의 axons을 소화 전문 glial 세포입니다. NMJs는 단단 대여섯 비 myel까지이 적용됩니다터미널 SCS를 inating - 그들이 직접 멤브레인 연락처 세에 이러한 그러나, 개별적으로, 가벼운 현미경에 의해 해결 될 수 없습니다. 여러 접근법은 개별적으로 터미널 SCS을 시각화하기 위해 존재합니다. 이 중 어느 것도하지만, 완벽한 없습니다. 예를 들어, 하나의 세포가 염색이 가득한 microelectrode에 찔려 죽은 아르 염료 충전은 두 번째 하나를 작성하기 전에 표시된 셀을 파괴해야합니다. 이 이후의 시간 경과 녹음 3 호환되지 않습니다. SCS의 멀티 스펙트럼 &quot;Brainbow&quot;라벨은 형광 단백질의 조합 표현 사를 사용하여 달성되었습니다. 그러나,이 기술은 여러 transgenes을 결합 필요하며 사용 발기인의 표현 패턴에 의해 제한됩니다. 앞으로 SCS에서 &quot;사진 전환 가능한&quot;단백질의 표정은 또 다른 대안이 다섯 수 있습니다. 여기 순차 사진 표백 한 셀이 표백 곳, 그리고 빼기 얻은 자신의 이미지를 제시한다. 우리는 믿고이 접근하는 -의 편리함과 다양성으로 인해이 -이 생체에 사용하고 다른 세포 유형, 해부학 사이트 또는 종 6 이전 할 수 있습니다 특히 neuroscientist의 기술 팔레트에 지속적인 추가를 나타냅니다. triangularis sterni 근육의 explants에서 터미널 SCS에 대한 표백 순서와 후속 공 촛점 시간 경과 현미경의 다음 프로토콜에서, 우리는 세부 응용 프로그램을. 이, 얇은 표면 쉽게 해부하는 신경 근육 준비 7,8는 NMJ 개발, 생리와 병리 9 연구에 유용 입증되었습니다. 마지막으로, 우리는 고정 고해상도 공 촛점 이미징, immunohistochemistry 또는 ultrastructural 시험 상관 수행 한 후 triangularis sterni 근육이 준비 방법에 대해 설명합니다.

이미징 요리 준비 triangularis sterni의 explant의 예는 그림 1G에 표시됩니다. triangularis 근육이 근육 섬유의 몇 층으로 만 구성으로 explant는 영상 NMJs 예를 생체에 특히 적합합니다. 이 유전자 변형 마우스 라인에서 파생 explants에서 고해상도 이미지를 얻을 수 있도록하는 하이라이트 SCS (PLP-GFP 2) 및 / 또는 axons (Thy1-XFP 1) 중. 고품질 영상을위한 중요한 요?...

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Sequential Photo-bleaching to Delineate Single Schwann Cells at the Neuromuscular Junction

이러한 신경 근육 접합 (NMJs)에서 터미널 Schwann 세포 (SCS)과 같은 밀도가 높은 포장 조직에 개별 셀을 표시하는 것은 도전입니다. &quot;선형 사진 표백&quot;표백 순서는 시간 경과 영상과 결합 할 수있는 triangularis sterni의 근육 explant, 편리하게 신경 근육 준비에 예를 들어, 단일 터미널 SCS를 delineating 수 있으며<em&gt; 후 특별</em&gt; immunostainings.

연속 신경 근육 분기점에서 싱글 Schwann 세포를 윤곽을 그리다하는 사진 표백

Sequential photo-bleaching provides a non-invasive way to label individual SCs at the NMJ. The NMJ is the largest synapse of the mammalian nervous system ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.5K 조회수.  Technische Universität München. 이러한 신경 근육 접합 (NMJs)에서 터미널 Schwann 세포 (SCS)과 같은 밀도가 높은 포장 조직에 개별 셀을 표시하는 것은 도전입니다. "선형 사진 표백"표백 순서는 시간 경과 영상과 결합 할 수있는 triangularis sterni의 근육 explant, 편리하게 신경 근육 준비에 예를 들어, 단일 터미널 SCS를 delineating 수 있으며 후 특별 immunostainings.

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Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The Drosophila larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila is well known for the ease of powerful genetic manipulations and the larval nervous system has proven particularly useful in studying not only normal function but also perturbations that accompany some neurological disease (Lloyd and Taylor, 2010). Many key synaptic molecules found in Drosophila are also found in mammals and like most CNS excitatory synapses in mammals, the Drosophila NMJ is glutamatergic and demonstrates activity-dependent remodeling (Kohet al. , 2000). Additionally, Drosophila neurons can be individually identified because their innervation patterns are stereotyped and repetitive making it possible to study identified synaptic terminals, such as those between motor neurons and the body-wall muscle fibers that they innervate (Keshishian and Kim, 2004). The existence of evolutionarily conserved synapse components along with the ease of genetic and physical manipulation make the Drosophila model ideal for investigating the mechanisms underlying synaptic function (Budnik, 1996).
The active zones at synaptic terminals are of particular interest because these are the sites of neurotransmitter release. NC82 is a monoclonal antibody that recognizes the Drosophila protein Bruchpilot (Brp), a CAST1/ERC family member that is an important component of the active zone (Waghet al. , 2006). Brp was shown to directly shape the active zone T-bar and is responsible for effectively clustering Ca2+ channels beneath the T-bar density (Fouquetet al. , 2009). Mutants of Brp have reduced Ca2+ channel density, depressed evoked vesicle release, and altered short-term plasticity (Kittelet al. , 2006). Alterations to active zones have been observed in Drosophila disease models. For example, immunofluorescence using the NC82 antibody showed that the active zone density was decreased in models of amyotrophic lateral sclerosis and Pitt-Hopkins syndrome (Ratnaparkhiet al. , 2008; Zweieret al. , 2009). Thus, evaluation of active zones, or other synaptic proteins, in Drosophila larvae models of disease may provide a valuable initial clue to the presence of a synaptic defect.
Preparing whole-mount dissected Drosophila larvae for immunofluorescence analysis of the NMJ requires some skill, but can be accomplished by most scientists with a little practice. Presented is a method that provides for multiple larvae to be dissected and immunostained in the same dissection dish, limiting environmental differences between each genotype and providing sufficient animals for confidence in reproducibility and statistical analysis.

Dissection and Imaging of Active Zones in the Drosophila Neuromuscular Junction

The neuromuscular junction (NMJ) of Drosophila melanogaster is an important model system for studying normal synaptic function as well as perturbations to synaptic function found in certain neurological diseases. We present a protocol for dissection of the Drosophila larval motor system and immunostaining for active zone proteins within the NMJ.

의 활성 영역의 해부 및 이미징 Drosophila 신경근육학 융티온

The Drosophila  larvae neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model for the study of synaptic structure and function. Drosophila  is well known for ...

연구

신경과학

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat muscles can offer significant advantage over traditionally used thicker muscles, such as those from the hind limb (e.g. gastrocnemius). Thin muscles allow for comprehensive overview of the entire innervation pattern for a given muscle, which in turn permits identification of selectively vulnerable pools of motor neurons. These muscles also allow analysis of parameters such as motor unit size, axonal branching, and terminal/nodal sprouting. A common obstacle in using such muscles is gaining the technical expertise to dissect them. In this video, we detail the protocol for dissecting the transversus abdominis (TVA) muscle from young mice and performing immunofluorescence to visualize axons and neuromuscular junctions (NMJs). We demonstrate that this technique gives a complete overview of the innervation pattern of the TVA muscle&#160;and can be used to investigate NMJ pathology in a mouse model of the childhood motor neuron disease, spinal muscular atrophy.

Dissection of the Transversus Abdominis Muscle for Whole-mount Neuromuscular Junction Analysis

In this video we demonstrate a protocol for dissection of the transversus abdominis muscle of the mouse and use immunofluorescence and microscopy to visualize neuromuscular junctions.

전신 탈염 신경 근육 정션 분석을위한 트랜스 대 복부 근육의 해부

Analysis of neuromuscular junction morphology can give important insight into the physiological status of a given motor neuron. Analysis of thin flat ...

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval neuromuscular junction (NMJ) in Drosophila. Previous studies have shown that the postsynaptic distribution of Dlg at the larval NMJ overlaps with that of Hu-li tai shao (Hts), a homologue to the mammalian adducins. In addition, Dlg and Hts are observed to form a complex with each other based on co-immunoprecipitation experiments involving whole adult fly lysates. Due to the nature of these experiments, however, it was unknown whether this complex exists specifically at the NMJ during larval development.
Proximity Ligation Assay (PLA) is a recently developed technique used mostly in cell and tissue culture that can detect protein-protein interactions in situ. In this assay, samples are incubated with primary antibodies against the two proteins of interest using standard immunohistochemical procedures. The primary antibodies are then detected with a specially designed pair of oligonucleotide-conjugated secondary antibodies, termed PLA probes, which can be used to generate a signal only when the two probes have bound in close proximity to each other. Thus, proteins that are in a complex can be visualized. Here, it is demonstrated how PLA can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval NMJ. The technique is performed on larval body wall muscle preparations to show that a complex between Dlg and Hts does indeed exist at the postsynaptic region of NMJs.

Detection of In Situ Protein-protein Complexes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction Using Proximity Ligation Assay

This protocol demonstrates how Proximity Ligation Assay can be used to detect in situ protein-protein interactions at the Drosophila larval neuromuscular junction. With this technique, Discs large and Hu-li tai shao are shown to form a complex at the postsynaptic region, an association previously identified through co-immunoprecipitation.

검출<em&gt; 현장에서</em상기&gt; 단백질 - 단백질 복합체<em&gt; 초파리</em근접 내고 분석을 사용하기&gt; 애벌레 신경 근육 접합부

Discs large (Dlg) is a conserved member of the membrane-associated guanylate kinase family, and serves as a major scaffolding protein at the larval ...

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic pathways. Quantitative descriptions are rarely performed, although genetic manipulations produce a range of phenotypic effects and variations are observed even among individuals within control groups.&#160;Emerging evidence shows that morphology, size and location of organelles play a previously underappreciated, yet fundamental role in cell function and survival. Here we provide step-by-step instructions for performing quantitative analyses of phenotypes at the Drosophila larval neuromuscular junction (NMJ). We use several reliable immuno-histochemical markers combined with bio-imaging techniques and morphometric analyses to examine the effects of genetic mutations on specific cellular processes. In particular, we focus on the quantitative analysis of phenotypes affecting morphology, size and position of nuclei within the striated muscles of Drosophila larvae. The Drosophila larval NMJ is a valuable experimental model to investigate the molecular mechanisms underlying the structure and the function of the neuromuscular system, both in health and disease. However, the methodologies we describe here can be extended to other systems as well.

Why Quantification Matters: Characterization of Phenotypes at the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Morphology, size and location of intracellular organelles are evolutionarily conserved and appear to directly affect their function. Understanding the molecular mechanisms underlying these processes has become an important goal of modern biology. Here we show how these studies can be facilitated by the application of quantitative techniques.

상기 표현형의 특성을 : 정량이 중요한 이유<em&gt; 초파리</em&gt; 애벌레 신경 근육 학 분기점

Most studies on morphogenesis rely on qualitative descriptions of how anatomical traits are affected by the disruption of specific genes and genetic ...

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous system. SC-selective genetic manipulation in living animals is a powerful technique for studying the molecular and cellular mechanisms of SC myelination and demyelination in vivo. While knockout/knockin and transgenic mice are powerful tools for studying SC biology, these methods are costly and time consuming. Viral vector-mediated transgene introduction into the sciatic nerve is a simpler and less laborious method. However, viral methods have limitations, such as toxicity, transgene size constraints, and infectivity restricted to certain developmental stages. Here, we describe a new method that allows selective transfection of myelinating SCs in the rodent sciatic nerve using electroporation. By applying electric pulses to the sciatic nerve at the site of plasmid DNA injection, genes of interest can be easily silenced or overexpressed in SCs in both neonatal and more mature animals. Furthermore, this in vivo electroporation method allows for highly efficient simultaneous expression of multiple transgenes. Our novel technique should enable researchers to efficiently manipulate SC gene expression, and facilitate studies on SC development and function.

In Vivo Gene Transfer to Schwann Cells in the Rodent Sciatic Nerve by Electroporation

Here, we present an in vivo technique for gene transfer to Schwann cells (SCs) in the rodent sciatic nerve. This simple technique is useful for investigating signaling mechanisms involved in the development and maintenance of myelinating SCs.

Electroporation에 의해 쥐 좌골 신경의 슈반 세포로 생체 내 유전자 전달에

The formation of the myelin sheath by Schwann cells (SCs) is essential for rapid conduction of nerve impulses along axons in the peripheral nervous ...

Measuring Neuromuscular Junction Functionality

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is impaired, such as aging and amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Here we describe an experimental protocol that can be used to measure NMJ functionality by combining two types of electrical stimulation: direct muscle membrane stimulation and the stimulation through the nerve. The comparison of the muscle response to these two different stimulations can help to define, at the functional level, potential alterations in the NMJ that lead to functional decline in muscle.
Ex vivo preparations are suited to well-controlled studies. Here we describe an intensive protocol to measure several parameters of muscle and NMJ functionality for the soleus-sciatic nerve preparation and for the diaphragm-phrenic nerve preparation. The protocol lasts approximately 60 min and is conducted uninterruptedly by means of a custom-made software that measures the twitch kinetics properties, the force-frequency relationship for both muscle and nerve stimulations, and two parameters specific to NMJ functionality, i.e. neurotransmission failure and intratetanic fatigue. This methodology was used to detect damages in soleus and diaphragm muscle-nerve preparations by using SOD1G93A transgenic mouse, an experimental model of ALS that ubiquitously overexpresses the mutant antioxidant enzyme superoxide dismutase 1 (SOD1).

A functional assessment of the neuromuscular junction (NMJ) can provide essential information on the communication between muscle and nerve. Here we describe a protocol to comprehensively evaluate both the NMJ and muscle functionality using two different muscle-nerve preparations, i.e. soleus-sciatic and diaphragm-phrenic.

Neuromuscular junction (NMJ) functionality plays a pivotal role when studying diseases in which the communication between motor neuron and muscle is ...

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal macropatch recordings of synaptic currents from visualized boutons at the Drosophila larval NMJ. This technique requires customized fabrication of recording micropipettes, as well as a compound microscope equipped with a high magnification, long-distance water immersion objective, differential interference contrast (DIC) optics, and a fluorescent attachment. The recording electrode is positioned on the top of a selected synaptic bouton visualized with DIC optics, epi-fluorescence, or both. The advantage of this technique is that it allows monitoring the synaptic activity of a limited number of sites of release. The recording electrode has&#160;a diameter of several microns, and the release sites positioned outside of the electrode rim do&#160;not significantly affect the recorded currents. The recorded synaptic currents have fast kinetics and can be readily resolved. These advantages are especially important for the studies of mutant fly lines with enhanced spontaneous or asynchronous synaptic activity.

Focal Macropatch Recordings of Synaptic Currents from the Drosophila Larval Neuromuscular Junction

Synaptic currents can be recorded focally from visualized synaptic boutons at the Drosophila third instar larvae neuromuscular junction. This technique enables monitoring the activity of a single synaptic bouton.

초파리 애벌레 신경 근육 학 교차로에서 시 냅 스 전류의 초점 Macropatch 녹음

Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an excellent model system to study glutamatergic synaptic transmission. We describe the technique of focal ...

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The well characterized larval neuromuscular junction is often used for such studies. However, rapid larval development followed by muscle histolysis and nervous system remodeling during metamorphosis makes this model problematic for the study of slow age-dependent degenerative changes like those occurring in amyotrophic lateral sclerosis. Alternatively, adult flies live for 90 days and the adult leg can be used to study motor neuron changes over the course of adult lifespan using in vivo fluorescent imaging through the cuticle. Here, we describe a leg dissection technique coupled with immunocytochemistry, which allows for the study of molecular changes at the neuromuscular junction of identified adult leg motor neurons. These techniques can be coupled with a myriad of antibodies labeling both pre- and post-synaptic structures. Together these procedures allow a more complete characterization of slow age-dependent changes in adult flies and can be applied across multiple motor neuron disease models.

Dissection and Immunohistochemistry of the Drosophila Adult Leg to Detect Changes at the Neuromuscular Junction for an Identified Motor Neuron

We describe a dissection technique that preserves the architecture of the neuromuscular junction and enables a detailed immunocytochemical study of motor neurons in the adult Drosophila leg.

확인된 모터 뉴런을 위한 신경근육 정션에서 변경을 검출하기 위하여 Drosophila 성인 다리의 해부 및 면역 조직 화학

Drosophila melanogaster represents a genetically tractable model to study neuronal structure and function, and subsequent changes in disease states. The ...

Registration of Calcium Transients in Mouse Neuromuscular Junction with High Temporal Resolution using Confocal Microscopy

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a cascade of events leading to neurotransmitter release. Moreover, changes in presynaptic calcium levels mediate the activity of many intracellular proteins and play an important role in synaptic plasticity. Studying calcium signaling is also important for finding ways to treat neurodegenerative diseases. The neuromuscular junction is a suitable model for studying synaptic plasticity, as it has only one type of neurotransmitter. This article describes the method for loading a calcium-sensitive dye through the cut nerve bundle into the mice's motor nerve endings. This method allows the estimation of all parameters related to intracellular calcium changes, such as basal calcium level and calcium transient. Since the influx of calcium from the cell exterior into the nerve terminals and its binding/unbinding to the calcium-sensitive dye occur within the range of a few milliseconds, a speedy imaging system is required to record these events. Indeed, high-speed cameras are commonly used for the registration of fast calcium changes, but they have low image resolution parameters. The protocol presented here for recording calcium transient allows extremely good spatial-temporal resolution provided by confocal microscopy.

The protocol describes the method of loading a fluorescent calcium dye through the cut nerve into mouse motor nerve terminals. In addition, a unique method for recording fast calcium transients in the peripheral nerve endings using confocal microscopy is presented.

Estimation of the presynaptic calcium level is a key task in studying synaptic transmission since calcium entry into the presynaptic cell triggers a ...

Visualizing the Morphological Characteristics of Neuromuscular Junction in Rat Medial Gastrocnemius Muscle

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of three essential histological components: the pre-synaptic motor axon terminals, post-synaptic nicotinic acetylcholine receptors (AchRs), and peri-synaptic Schwann cells (PSCs). In order to demonstrate the morphological characteristics of NMJ, the rat medial gastrocnemius muscle was selected as the target-tissue and examined by using multiple fluorescent staining with various kinds of biomarkers, including neurofilament 200 (NF200) and vesicular acetylcholine transporter (VAChT) for the motor nerve fibers and their pre-synaptic terminals, alpha-bungarotoxin (&#945;-BTX) for the post-synaptic nicotinic AchRs, and S100 for the PSCs. In this study, staining was performed in two groups: in the first group, samples were stained with NF200, VAChT, and &#945;-BTX, and in the second group, samples were stained with NF200, &#945;-BTX, and S100. It was shown that both protocols can effectively demonstrate the detailed structure of NMJ. Using the confocal microscope, morphological characteristics of the pre-synaptic terminals, post-synaptic receptors, and PSC were seen, and their Z-stacks images were reconstructed in a three-dimensional pattern to further analyze the spatial correlation among the different labeling. From the perspective of methodology, these protocols provide a valuable reference for investigating the morphological characteristics of NMJ under physiological conditions, which may also be suitable to evaluate the pathological alteration of NMJ, such as peripheral nerve injury and regeneration.

The protocol shows a method to examine spatial correlation among the pre-synaptic terminals, post-synaptic receptors, and peri-synaptic Schwann cells in the rat medial gastrocnemius muscle using fluorescent immunohistochemistry with different biomarkers, namely, neurofilament 200, vesicular acetylcholine transporter, alpha-bungarotoxin, and S100.

쥐 내측 위장근에서 신경근 접합부의 형태학적 특성 시각화

The neuromuscular junction (NMJ) is a complex structure serving for the signal communication from the motor neuron to the skeletal muscle and consists of ...