이 절차의 전반적인 목표는 Drosophila의 성인 다리에 대한 해부 방법을 설명하는 것입니다. 이 기술은 큐티클의 일부를 제거, 신경 및 근육 아키텍처를 보존 하는 방식으로 기본 조직을 노출. 이 절차는 우리가 표준 면역 세포 화학 기술을 사용하여 식별 된 운동 신경 식소에 대한 신경 근육 접합을 특성화 할 수 있습니다.
해부는 비교적 오랜 기간 동안 발생하는 느린 퇴행성 변화의 연구에 특히 유용합니다. 시간 측면은 중요한 고려 사항입니다, Drosophila 애벌레의 잘 특징적인 신경 근육 접합은 변태의 개시 의 앞에 대략 5 7 일 동안 안정하기 때문에. 반대로, 성인 뉴런은 성인 비행의 일생 내내 존재하며, 야생 식, 실험실 에서 자란 드로소필라 멜라노가스터의 경우 약 90 일 동안 존재합니다.
이 기술은 유연하며 상이한 질병 모델에 대한 다양한 유전자형에 적용될 수 있으며, 드로소필라에 사용할 수 있는 다양한 항체를 모델 시스템으로 활용한다. 이 절차의 전반적인 목표는 Drosophila의 성인 다리에 대한 해부 방법을 설명하는 것입니다. 이 기술은 큐티클의 일부를 제거, 신경 및 근육 아키텍처를 보존 하는 방식으로 기본 조직을 노출.
페인트 브러시를 사용하여 유리 우물또는 접시에 차가운 메탄올로 파리를 약 30초에서 1분 동안 옮춥시다. 메탄올은 큐티큘러 탄화수소를 용해시키고, 파리는 수성 용액에 떠 다니기보다는 침수될 수 있습니다. 집게로 조심스럽게 PBS로 이동합니다.
얼음 차가운 PBS에서 세 번 헹구어 과잉 메탄올을 제거하고 해부 및 고정 될 때까지 PBS에서 얼음에 파리를 유지합니다. 이 시점에서 파리는 가능한 가장 짧은 시간 내에 해부되고 고정되어야하며, 바람직하게는 30 분 이내에 고정해야합니다. 차가운 PBS로 채워진 실리콘 엘라스토머 해부 접시로 날아갑니다.
5번 듀몬트 집게 2쌍을 사용하여 콕스의 메타토라시 다리를 제거하거나 반나스 가위로 다리를 자른다. 다리를 플라스틱으로 잘 옮기고, 24개의 웰 플레이트는 PBS 1마일로 채워져 있으며, 모든 다리가 제거되어 우물로 옮겨질 때까지 접시를 얼음 위에 보관합니다. 우리는 일반적으로 잘 당 20 다리를 사용합니다.
PBS 솔루션을 1밀리리터 FA 솔루션으로 교체하고 30분 동안 누에이터에서 회전합니다. 누에이터 설정은 중간 속도로 설정됩니다. 이 시간 동안 다리가 용액에 완전히 침수되었는지 확인합니다.
FA 용액을 제거하려면 1mil PBS에서 3번 빠르게 세척한 다음 1mil PBS에서 각각 5분 동안 3개의 세척을 추가합니다. 해부 단계 전과 중에 얼음 에 하나의 밀 PBS에 조직을 개최합니다. Drosophila 다리 해부학의 간략한 개요를 제공하기 위해, 다리 세그먼트는 coxa, 트로챈터, 대퇴골, 경골 및 5 개의 타르 살 세그먼트를 포함하여 표시됩니다.
여기서 우리는 뒤쪽 쪽에 존재하는 벌거 벗은 표피와 는 반대로 감각 강모의 존재에 의해 인식 다리의 전방 보기를 볼 수 있습니다. 근위축축과 등쪽-복부축의 방향도 표시됩니다. 이 해부 절차는 근위 대퇴골에서 작은 표피 조각을 제거하여 경골 레바터 근육을 안쪽으로 내포하는 축삭 아버를 연구 할 수 있도록합니다.
우리의 이전 작품은 추정 신경 아세포 눈 혈통에서 유래 표시 된 식소에 초점을 맞추고있다. 절차의이 부분에서, 우리는 대퇴골의 전방 측면에서 큐티클을 제거합니다. 해부 집게는 성공에 매우 중요하며, 5번 슈퍼 미세 포셉끝에 약간의 굴곡을 도입하면 큐티클을 피상적으로 잡을 수 있는 경사를 제공하여 조직을 망칠 수 있습니다.
해부를 위해 PBS의 실리콘 엘라스토머 접시에 다리를 옮기습니다. 한 쌍의 집게를 사용하여, 오른쪽에 표시된 것처럼 실리콘 엘라스토머 접시에 경골 세그먼트를 고정합니다. 다른 집게를 사용하여 베벨 쪽을 아래로 잡고, 대퇴골의 말단 끝에 큐티클 조각을 잡고 트로 챈터를 향해 근위 방향으로 당깁니다.
대퇴골의 근위 쪽 끝에 걸쳐 벌거 벗은 근육이 보일 때까지 체계적으로 큐티클을 제거하십시오. 모든 다리가 해부되면 PBS를 FA 솔루션으로 교체하여 중간 속도로 누두기를 흔들어 30 분 동안 다리를 포스트픽스하십시오. 그 후, 샘플을 1mil PBS에서 3배 빠르게 세척한 다음 PBT 용액에서 각각 5분 동안 세 번 세척합니다.
조직을 차단하려면 1mil PBT를 PBT에서 희석한 1밀 5%일반 염소 세럼으로 구성된 블로킹 솔루션으로 교체하십시오. 해부된 다리를 실온에서 4시간 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 배양합니다. 차단 용액을 제거하고 차단 용액에서 희석된 1차 항체로 교체하십시오.
여기서는 1~200개의 희석에 큰 디스크를 사용하고 있습니다. 접시를 셰이커에 다시 넣고 하룻밤 사이에 4도에서 배양하십시오. 1차 항체 배양에 이어, 1차 항체를 1mil PBT에서 3회 간 간략하게 세척한 다음 각각 15분 동안 3회 세척한다.
실온에서 적어도 2 시간 동안 또는 섭씨 4도에서 하룻밤 동안 한 공장에서 5 % 일반 염소 혈청에서 조직을 다시 차단하십시오. 차단 용액을 제거하고 적절한 희석 형광 공주 이차 항체의 300 마이크로 리터를 추가합니다. 또한, 1에 추가 2000 형광 컨쥬게이트 남근의 희석 근육 라벨.
인큐베이션을 위해 실험실 밀봉 테이프와 뚜껑으로 우물을 밀봉하십시오. 또한 알루미늄 호일에 플레이트를 싸서 빛으로부터 형광을 보호합니다. 실온에서 6~8시간 또는 섭씨 4도에서 하룻밤을 배양합니다.
언바운드 이차 항체를 제거하려면, 1차 항체를 세척할 때 이전에 설명한 유사한 방식으로 PBT로 세척을 수행한다. 이 단계를 마친 후 샘플을 장착하고 이미지화할 준비가 되었습니다. 다리를 앞쪽으로 위로 놓고 필요한 경우 추가 마운팅 미디어로 덮습니다.
덮개의 모서리를 점토 공을 가로질러 부드럽게 긁어냅니다. 결과 점토는 슬라이드와 커버 슬립 사이의 스페이서 역할을하므로 조직이 분쇄되지 않습니다. 다리 의 상단에 닿을 때까지 덮개 슬립을 누릅니다.
매니큐어로 가장자리를 밀봉하고 이미징까지 4도에 보관하십시오. 서면 프로토콜의 섹션 4에 설명된 이미징 매개 변수를 사용하여 공초점 현미경 검사법에 의한 이미지. 해부 프로토콜의 유효성을 검사하기 위해, 우리는 낮은 배율에서 위상 대비 현미경 검사법에 의해 먼저 다리를 이미지합니다.
다음은 왼쪽에 좋은 해부의 패널 A에 대한 예이며, 근육 섬유가 중단된 오른쪽의 나쁜 해부입니다. 패널 C는 근육이 중단되지 않은 좋은 해부의 공초점 이미지를 보여줍니다. 대조적으로, 패널 D는 화살에 의해 표시된 대로 근육 섬유가 없는 해부 도중 손상된 다리를 보여줍니다.
여기서, 우리는 항 고추냉이 과산화증을 가진 이미지된 다리를 염색하여 뉴런 과정을 검출하고, 여기에 녹색, 안티 디스크로 표시되어, 빨강으로 표시된 기둥 글루타민산 수용체 클러스터링을 용이하게 하고, 근육에 라벨을 붙이는 프할로이딘을 블루로 표시했습니다. 전송된 라이트 채널로 20X 배율로 캡처하면 해부된 영역을 쉽게 볼 수 있습니다. 항체는 부분적으로 훼손된 부위로 침투하며, 백색 화살표에 의해 표시된 대로 표피를 통해 볼 수 있다.
각 다리 운동 뉴런은 근육을 내면으로 만들 때 고정 관념투영을합니다. 우리의 작품은 경골 레바터 근육을 내면으로 운동 뉴런에 초점을 맞추고, 여기에 박스 형 영역으로 표시하고 흰색 화살표로 표시. 오른쪽 상단에 2X 줌이 있는 더 높은 배율 60X에서는 녹색으로 표시된 부폰을 효과적으로 이미지화하고 빨간색으로 표시된 주변 DLG를 효과적으로 이미지할 수 있습니다.
줌을 더 늘리거나 100X 목표로 단계적하면 오른쪽 아래와 같이 판튼 크기와 형태의 정량화를 할 수 있습니다. 면역 세포화학과 결합된 이 해부 기술을 사용하여, 우리는 화살표에 의해 표시된 야생 모형 통제에 비해, 노화 H71Y 다리에 여기에서 도시된 ALS의 sod1 돌연변이 모형에 있는 H 의존적인 bouton 팽윤이 있다는 것을 것을을 발견했습니다. 부튼 크기는 오른쪽에 꿀벌 떼 플롯에 정량화된다.
우리는 또한 H71Y 돌연변이체의 녹색으로 표시된 약하게 염색된 HRP 축삭 내에서 빨간색으로 표시된 액티브 존 마커 Bruchpilot의 감소를 발견했습니다. 신경변성을 연구하기 위해, 유비퀴티드 단백질 응집체는 항체 FK2에 의해 종종 검출되고, FK2 양성 말장난으로 여기에 표시되고, 노화된 소드 H71의 축축악및 근육에서, 화살표로 표시된다. 마지막으로, 미토콘드리아는 경골 레바터 근 내의 빨간색으로 도시된 바와 같이 항 ATP5a 단일 클론 항체를 사용하여 면역 세포화학에 의해 시각화될 수 있다.
우리는 미토콘드리아가 H71Y 돌연변이체의 나이로 확대된다는 것을 발견했습니다. 일단 마스터되면, 해부 된 다리 준비 및 관련 된 항체 염색 다양 한 시점에서 선호 하는 돌연변이에 대 한 성인 신경 근육 접합에서 분자 변화를 분석 할 수 있습니다.
