이 작품은 웰컴 트러스트 부여 WT091939MA로 운영되었습니다. 알랭 Filloux는 로얄 협회가 지원됩니다.

1. 박테리아 변종과 문화 <ol><li> (표준 CaCl 2 치료 electroporation을 사용하여) 15 E.를 변형하여 대장균받는 셀을 (먹이, P) 엔지니어 lacZ 유전자 (표 1)의-complementation을 허용하는 플라스미드와 대장균 DH5α 세포를. 판 Luria-Bertani 한천 플레이트에 변형 세포 (LBA, 1.5 %의 한천)가 포함 된 5 - 브로 모-4 - 클로로 인돌 릴-β-D-galactopyranoside (X-여자) 40 MG / ML 최종 농도 및 적절한 항생제. ° C 하룻밤 다음과 같은 아침 (§ 1.3 참조) 푸른 transformants에 대해 선택한 37 품다. </li><li> T6SS - 활성 녹농균 기증자 세포 성장 (D +) 또는 T6SS - 비활성 (D-) (표 1) 밤 LBA에 37 번 ° C. 예제에서 우리는 P.를 사용 여기에 제시된 aeruginosa의 retS가 소유 변형constitutively 활성화 H1-T6SS 16 H1-T6SS 유전자 클러스터 (표 1)의 삭제와 isogenic 돌연변이. </li><li> 다음 날, E. 사이에 밝은 파란색 복제를 inoculating하여 aerated 플라스크에 밤새 액체 문화를 준비 판에서 대장균의 transformants (P)은 적절한 항생제로 보충 tryptic 간장 국물 (TSB)의 5 ML에 § 1.1에 설명되어 있습니다. 37 교반에 따라 성장 ° C. § 1.2에 설명 된 판에서 - (D) (D +) 및의 단일 식민지와 동일하게 진행합니다. </li></ol> 2. 경쟁 분석 <ol><li> 다음 날 실험에 대한 LBA 판을 준비합니다. 이 플레이트가 제대로 (분젠 버너 근처 또는 층류 캐비닛에 표시) 건조되어 있는지 확인하십시오. (D -) 긴장 (D +)에 대해 &quot;분석 - 입력&quot;(A-입력) 판을 준비하고, (P </strong&gt;). &quot;검정 출력&quot;(A-출력) 변종에 대한 판을 준비 (D - + P)와 (D + + P). 분할하고 이에 따라 번호판을 레이블을 붙입니다. </li><li> 하루 아침에 성장 후 (§ 1.3 참조), 입력 세균성 문화 (D - D +와 P)의 광학 밀도 (OD 600nm)를 측정하고 각 변형의 1 단위 OD 600nm에 세포 밀도에 상응를 얻을하는 데 필요한 볼륨을 계산 . 각 &quot;입력&quot;세포 배양 (D - D +와 P) 처음 멸균 1.5 ML Eppendorf 튜브에 수집됩니다. </li><li> 상온에서 1 분 동안 13,000 rpm으로 세균 샘플을 원심 분리기하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> D의 알약을 Resuspend -, D +, 및 P의 부드러운 pipetting하여 신선한 TSB의 100 μl의 문화, 그리고 각 이리와! 빨리 10 ML의 예방&quot;A-입력&quot;플레이트 (§ 2.1 작성)의 한 곳으로 부담을 sponding. </li><li> &quot;A-출력&quot;판을 (§ 2.1 작성) 예방. 더 정확하게, 30 μl (P)과의 30 μl로 (D +)의 부드럽게 30 μl를 혼합 (D -) 두 개의 Eppendorf 튜브 (사용 된 문화가 § 2.4에 설명되어있는 것을주의) 30 ML (P)과 . 믹스 (D + / P)의 20 μl의 예방 및 (D - / P)의 &quot;A-출력&quot;판에 개별적 있습니다. 장소 근처에 분젠 버너를 건조하고 박테리아 살해가 진행되는 동안 시간의 적절한 기간 동안 37 ° C에서 보육의 판을 게재 할 수 있습니다. P.의 경우 aeruginosa는 ​​효율적인 세균 살해은 5 시간의 부화 후 T6SS 결함이있는 변형과 활성 T6SS를 비교했을 때 관찰된다. </li></ol> 3. t의 질적 전망대그 세균 살인 <ol><li> 40 μg / ML 분석의 판독을위한 X-여자를 포함 LBA 판을 준비합니다. 플레이트는 &quot;판독 입력&quot;또는 격리 된 박테리아 또는 &quot;판독 출력&quot;또는 &quot;R-출력&quot;혼합 박테리아 문화를 파악하고 따라서 죽이는 성능을 읽을를 발견하려면 &quot;R-입력&quot;라고합니다. 이 번호판은 제대로 건조도 필요합니다. 그 뒤에 다른 네 동일한 부분에 금속판을 나눈다 0, 10 -1, 10 -2, 10 -3이 부분을 주석 (§ 3.3 참조) 한천 플레이트에 탐지하는 박테리아 문화의 dilutions을 지정. 희석 같은 곳에서 흰색 / 파란색 박테리아 비율의 반 정량 평가를 할 수 있습니다. </li><li> &quot;A-입력&quot;플레이트 (§ 2.4 참조)에서 멸균 루프 개인 세균 명소와 &quot;A-출력&quot;플레이트 (§ 2.5 참조) 수집 및 TSB 1 ML을 포함하는 별개의 1.5 ML Eppendorf 튜브의 각 자리를 resuspend. 효율적으로 resuspend 30 분 동안 Eppendorf 흔드는 블록에 배치세균. </li><li> TSB 900 μl를 포함하는 5 회 3 Eppendorf 튜브 일련의 준비와 10 -3 ~ 10 배 시리얼 dilutions까지 각 resuspended 곳으로 진행합니다. 피펫 팁을 변경하고 각 희석 단계 사이의 소용돌이 5 초에해야합니다. </li><li> , undiluted 정지에 가장 희석로 시작하여 40 μg / ML X-여자를 포함 잘 말린 LBA 판에 § 3.3에서 조리하여 세균 dilutions의 야생 &quot;A에 대한 다음의&quot;R-​​입력 &#39;판을 만들기 위해 진행 - 입력 &quot;장소와&quot;A-출력 &quot;부분 (그림 2) R-출력&quot;에 대한 판 &quot;. 동질적인 세균 현탁액을 유지 야생로 이동하기 전에 잠시 소용돌이 각 관. 구역 내에 결과, 세중의에 자리 20 μl (그림 2)의 재현성하십시오. 장소는 개별적으로 접시에 분리 된 상태로 유지하고 서로를 향해 활강하지 않아도 돼 이후 판의 상대적 건조는이 단계에서 중요합니다. 경쟁 분석의 정량화는 실험이 단계에서도 가능합니다. 단계 3.3에 이어, 40 μg / ML X-여자를 포함 LBA 플레이트에 희석 10 -3 100 μl을 알리십시오. 결과의 재현성를 들어, &#39;A-출력 &quot;판의 각 지점에 대한 세중의에 도금을 수행합니다. ° C 배양기 박 (16 시간의 배양에 해당) 37 년에 희석 판을 놓습니다. 푸른 식민지 (살아 남은 P 세포)의 계산을 수행합니다. 경쟁의 5 시간 후 얻은 전형적인 결과는 그림 3에 표시됩니다. </li><li> 각 지점에서 초과 액체의 흡수를 허용하도록 무균 지대 내의 플레이트 개방 (NO 뚜껑)를 둡니다. </li><li> 밤에는 37 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다. 이 부화 시간 동안 살인은 여전히 두 변종 접촉에 아직도 있기 때문에 (D + / P) 혼합에서 발생합니다. </li><li> 사진을 찍으또는 출력 분석 (그림 2)에 대한 번호판을 검사합니다. 장소는 주로 파란색으로 남아 어디서 나타냅니다 E. 대장균은 P.에 의해 살해되지 않았습니다 aeruginosa. 그게 사건 때 E. 대장균은 T6SS - 결함이있는 P.과 혼합되어 aeruginosa 변형 (D-) (그림 2, 오른쪽 하단에있는 판). </li></ol>

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이 문서에서 제시하는 방법은 T6SS로 인한 bactericidal / bacteriostasis 활동의 시각적 관찰 할 수 있습니다. 검정은 한천 플레이트의 표면에 수행됩니다. 그것은 이전에 혼합 박테리아 액체 문화와 수행 T6SS에 의존 살해 분석 때문에 두 박테리아 팔 사이에 꾸준한 접촉의 부족의 가능성이 효율적 아니라는 것을 보여왔다. T6SS는 대상 셀 17에 DNA를 주입하는 bacteriophages에서 사용하는 것과 유사한 메커니즘으로 작동하도록 생각됩니다. 액체 문화에서 T6SS의 튜브와 같은 구조가 더 쉽게 손상 될 수 있으므로, 간 세균 연락이 손실 될 수 있으며, 독소는 효율적으로 전달되지 않습니다. 부화 시간의 측면에서, 우리는 기증자 변형과 먹이 사이에 설명하는 접촉 5 초기 시간은 P. 사이에 박테리아 살인을 관찰 할 충분 aeruginosa와 E. 그림 3에 도시 대장균, </strong&gt;. 그럼에도 불구하고,이 실험 조건을 최적화하기 위해 운동을 수행하여 부화 시간을 조정하는 것이 좋습니다. 이 방법은 색상 기반 기술이기 때문에, 출력 결과는 기증 스트레인의 착색에 의해 손상 될 수 있습니다. 예를 들어, P.의 경우 aeruginosa, 일부 변종은 먹이의 구별이 상대적으로 어렵게, 검정 판독을 방해 할 수 등 pyocyanin 및 pyoverdine과 같은 색의 안료 높은 수준을 생산하고 있습니다. 예 마젠타 - 여자 또는 붉은 여자와 같은 다른 chromogenic β-갈 락토의 기판은, X-갤런 (표 1) 대신 사용할 수 있습니다. 경쟁 분석은 표시 장치에 대한 다른 기자 유전자를 이용하실 수 있습니다. 예를 들어, 유사한 분석은 또한 녹색 형광 단백질이라는 수수께끼할까요? 12을 사용하여 수행되었습니다. 우리 분석은 양적되지 않고, 좋은 표시를 제공합니다T6SS 활동은 생존 또는 기자 먹이의 살해를 기반으로하기 때문입니다. 이 기술은 쉽게 모든 세균 종에서 T6SSs의 bactericidal / bacteriostasis 활동을 평가하는 것이 편리라는 장점을 제공합니다. 지금까지 T6SS의 활동은 그람 음성 박테리아와 T6SS에 민감한 그람 양성 세균의 알 수없는 예에 대해 표시되었습니다 아직 12 신고되었습니다. 이 테스트 할 수있는 다른 박테리아 종의 문화에 비 호환성 (예 성장 온도, 산소, 특정 미디어)으로 간주 할 것을 또한 분명합니다. 우리 검정도 분비 독소도 흔적이 먹이를 죽일 수있는 충분한 될 수 있기 때문에 T6SS 구성 요소의 어떤 절대적으로 필수적입니다 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 문화 표면에 뜨는과 서양 얼룩를 사용하여 표준 절차 테스트 T6SS에 따라 달라 분비에 비해 T6SS의 약한 활동은 다음 명확하게 분석에 의해 감지 될 수분석. 그러나, 적절한 집락 형성 단위 (CFU) 계산은 여전히​​이 T6SS 활동의 정확한 정량화가 필요합니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약 / 재료의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 코멘트 </td></tr><tr><td> P. aeruginosa의 PAKΔ retS (D +) (활성 T6SS) </td><td> 연구실 변형 </td><td></td><td> 참조 16에 설명 </td></tr><tr><td> P. aeruginosa PAKΔ retS Δ H1-T6SS (D -) (비활성 T6SS) </td><td> 이 연구 </td><td></td><td> H1-T6SS 클러스터는 (유전자에게 PA0070에 PA0095을 포함한) 참조 18에 설명 된 절차에 따라 allelic 교환에 의해 삭제되었습니다. 최대 조각 프리 머 : mutator 조각은 프리 머의 다음 세트 생성되었습니다 : 5&#39;-ATGGTCAACGACATGGAGCTGGAG-3 &#39;및 5&#39;CGAGGCCGATCAGGCCTTCAGAACTGA-3 &#39;. 다운 조각 프리 머 : 5&#39;-TCAGGCCTTCAGAACTGAAGCGGCGCA-3 &#39; <pre> 5&#39;-GGTGGCGTTCAACAGTTCCATGTC-3 &#39; </pre></td></tr><tr><td> E.coli DH5α </td><td> Invitrogen </td><td> 18258-012 </td><td> F-φ80 락 ZΔM15 Δ (LAC ZYA-ARG F) U169 오락 A1 끝 A1 hsd R17 (R K - m K +) 검사하고 사진을 한모금 E44 λ-생 -1 gyr A96 상대 A1 </td></tr><tr><td> pBluescript II SK (+) </td><td> 애질런트 </td><td> 212205 </td><td> 이 벡터는 α-complementation에 사용되는 β-갈 락토의 α 펩타이드을 표현한다. </td></tr><tr><td> X-여자 </td><td> Invitrogen </td><td> 15520-018 </td><td> 40 μg / ML에서 사용 </td></tr><tr><td> Luria Bertani 한천 </td><td> 머크 - 화학 물질 </td><td> 1.10283.0500 </td><td></td></tr><tr><td> TSB (카세인 콩 국물) </td><td> Oxoid </td><td> CM109 </td><td></td&gt; </tr><tr><td> 와류 흔드는 천재 3 </td><td> IKA </td><td> 3340000 </td><td></td></tr><tr><td> 스캐너 </td><td> 엡손 </td><td> V700 </td><td></td></tr><tr><td> 분광 광도계 </td><td> WPA Biowave </td><td> CO8000 셀 밀도 측정기 </td><td></td></tr><tr><td> 자홍색 - 여자 </td><td> Bioworld </td><td> 30350001-1 (715241) </td><td></td></tr><tr><td> 붉은 여자 </td><td> 연구 유기물 </td><td> 1364c </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 표 1. 사용 스트레인, 플라스미드, 재료 및 시약. </td></tr></tbody></table>

a visual assay to monitor t6ss-mediated bacterial competition

유형 VI의 분비 시스템 (T6SSs)는 그람 음성 박테리아 타겟 세포의 1,2 다양한으로 단백질을 운반하고 주입 할 수 있도록 분자 nanomachines 있습니다. T6SS은 13 핵심 구성 요소로 구성하고 bacteriophages 3의 꼬리 - 관과 구조 유사성을 표시합니다. 파지는 튜브 및 대상 세균의 세포 봉투에 침투 DNA를 삽입 할 수있는 펑 쳐링 장치를 사용합니다. 그것은 T6SS는 표면에 effectors과 독소를 운전 세균 세포 봉투에서 특정 경로를 만드는 역 박테리오파지 장치입니다 제안합니다. 과정은 더 촬영 할 수 있으며 T6SS 장치는 따라서 이러한 목표에 effectors를 주입, 박테리아가 접촉하는 다른 세포를 구멍 수 있습니다. 꼬리 관과 T6SS의 펑 쳐링 장치 부품은 각각 4,5, HCP와 VgrG 단백질로 만들어집니다. T6SS의 기능성이 제품을 통해 입증되었습니다다양한 세균 병원균을 사용하여 tudies. 비브리오 cholerae의 T6SS는 C-터미널 고를 가교 도메인 6,7를 갖고 &quot;발전&quot;VgrG을 주입하여 진핵 숙주 세포의 세포 골격을 개조 할 수 있습니다. 또 다른 인상적인 예를 들어 최근 따라서 특정 미생물 틈새 시장 및 경쟁 환경 8,9,10에서 박테리아의 설립을 촉진, T6SS에 의존 방식으로 박테리아를 타겟으로하고 죽일 수 있습니다 녹농균을 사용하여 문서화되었습니다. 후자의 경우, 즉 세 T6SS - 분비 단백질, Tse1, Tse2 및 Tse3이 대상 세균 (그림 1)에 주입 독소로 확인되었습니다. 기증자 세포는 Tsi1, Tsi2 및 Tsi3 면역 단백질 8,9,10에 의해 중재 해독제 메커니즘을 통해 이러한 effectors의 해로운 영향으로부터 보호됩니다. T6SS - 실력 박테리아가 S에 공동으로 재배하는 경우이 항균 활성을 모니터링 할 수 있습니다다른 박테리아 종으로 또는 같은 종 8,11,12,13의 T6SS - 비활성 박테리아와 경쟁에서 olid 표면. 사용할 수있는 데이터는 항생제 제조사에 크게 의존 시간이 소요 CFU 계산을 포함하여 세균 경쟁 분석에 숫자 접근 방식을 강조했다. P. 같은 항생제 내성 변종의 경우 aeruginosa,이 방법이 부적절 할 수 있습니다. 또한, 100 개 이상의 박테리아 genomes 14 200 다른 T6SS loci의 식별과 편리한 검사 도구는 매우 바람직하다. 우리는 사용하기 쉬우 및 표준 실험실 자료와 시약을 필요로하는 검정을 개발했습니다. 방법은 lacZ 유전자의-complementation을 허용하는 먹이 (이 경우에는 대장균이 DH5α)로 기자 스트레인을 사용하여 T6SS에 의존 bactericidal / bacteriostasis 활동을 모니터링 할 수있는 신속하고 질적 기술을 제공합니다. 전반적으로,이 방법은 grap입니다혼성 집적 회로 및 한천 플레이트에 T6SS 관련 phenotypes의 빠른 식별 할 수 있습니다. 이 실험 프로토콜은 계정으로 이러한 성장 미디어, 온도 나 접촉 시간 등 특정 조건을 복용 다른 변종이나 세균 종에 적용 할 수 있습니다.

전형적인 결과는 표 1에 설명 된 긴장과 시약과 그림 1에 표시됩니다. 이 그림에 표시된 플레이트는 하루 아침에 부화 한 후 스캔했다. &quot;판독 - 입력&quot;접시는이 분석에서 사용되는 변종에 대한 일련 희석 패턴을 보여줍니다. 예상대로, E. 대장균하는 동안 기증자 P., overexpressing는 lacZ 유전자가 X-여자에 보충 미디어에 파란색 표시 부분 (P)를 먹이로 aeruginosa의 긴장 (D +, T6SS 활성화) 및 (D - T6SS 비활성) 흰색 남아 있습니다. 먹이와 T6SS 활성 스트레인 (D + / P) 사이의 혼합은 푸른 색의 실종을 보여 발견 된있는 &quot;판독 출력&quot;접시 따라서이 살해 당했다는 표시 먹이. 이것은 먹이를 outcompete 할 수있는 기증자의 능력을 보여줍니다. (에 푸른 색의 지속성D - / P) 판은 푸른 먹이를 죽이려는 비활성 T6SS 기증자의 무능력을 보여줍니다. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig1.jpg" alt="그림 1"/> 1 그림. E.의 죽이는 T6SS - 실력 P.에 의해 대장균 aeruginosa. P. aeruginosa는 ​​E.에 독소를 주입 T6SS 종속적 인 방식으로 대장균은 대상 셀 (흰색 화살표로 표시). 두 독소 Tse1 및 Tse3은 (황색 및 적색 원) E.에 주입 아르 대장균의 periplasm과 peptidoglycan 9 저하. Tse2 독소 (노란색 원)가 E.에 주입되는 대장균 세포질 및 정균 활동주세요 8,10 있습니다. 독소의 결합 작업은 대상 세포를 (번개와 두개골의 플래시) 살인. 대상 셀의 생존은 (그림 2 참조) 생산 β-갈 락토의 활동을 모니터링하여 감지 할 수 있습니다. P.는eruginosa은 면역 단백질 Tsi1, Tsi2 및 Tsi3 (각각 오렌지색, 노란색과 붉은 광장) 8,9,10에 의한 독소의 활동에 대해 보호됩니다. <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2.jpg" alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50103/50103fig2highres.jpg"/> 그림 2. 한천 플레이트 분석은 T6SS 종속적 인 박테리아 살인을 모니터링하는 방법이 그림에서 상부 D의 일련 dilutions 구성된 &quot;판독 - 입력 &#39;접시에 표시됩니다 -., D +, 및 P 입력 세포. P 입력 셀은 lacZ 유전자의 α-complementation로 인해 파란색이고 따라서 생산 β-갈 락토 cleaves는 X-여자 것을. 하단 부분에 활성 (D + / P) 사이의 세균 믹스의 일련 dilutions으로 구성된 &quot;판독 출력&quot;번호판을 표시됩니다 </str긴 사연&gt;, 또는 비활성 (D - / P), T6SS 기증자 P. E.로 aeruginosa 스트레인 대장균은 먹이. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50103/50103fig2large.jpg" target="_blank">큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img src="/files/ftp_upload/50103/50103fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. E.의 살인 정량화 P.에 의해 대장균 5 시간의 부화 후 aeruginosa이 있습니다. 그래프는 E.의 CFU 계산을 제시 대장균은 3.4 단계에 설명되어 있습니다. 결과는 살해의 대부분은 접촉 5 초기 시간 동안 진행되는 제안, T6SS +와 T6SS - 변종 사이에 3 배 차이를 보여 여기 소개했다.

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A Visual Assay to Monitor T6SS-mediated Bacterial Competition

우리는에 의해 중재 세균 경쟁 업체를 모니터 할 수있는 질적 분석을 설명<em&gt; 녹농균</em&gt; 유형 VI의 분비 시스템 (T6SS). 검정은을 가진 대장균 대상 세포의 생존 / 살인에 의존<em&gt; lacZ</em&gt; - 기자. 이 기술은 T6SS - 숙련 된 미생물의 bactericidal / bacteriostasis 활동을 평가하는 조절합니다.

T6SS로 인한 세균 경쟁을 모니터링 할 비주얼 분석

Type VI secretion systems (T6SSs) are molecular  nanomachines allowing Gram-negative bacteria to transport and inject proteins  into a wide variety of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.5K 조회수.  Imperial College London. 우리는에 의해 중재 세균 경쟁 업체를 모니터 할 수있는 질적 분석을 설명 녹농균 유형 VI의 분비 시스템 (T6SS). 검정은을 가진 대장균 대상 세포의 생존 / 살인에 의존 lacZ - 기자. 이 기술은 T6SS - 숙련 된 미생물의 bactericidal / bacteriostasis 활동을 평가하는 조절합니다.

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Using Luciferase to Image Bacterial Infections in Mice

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes. In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific immune cell types, viral pathogens, parasites and bacteria can be followed in real-time within living animals 1-2. Application of bioluminescence imaging to the study of pathogens has advantages as compared to conventional strategies for analysis of infections in animal models3-4. Infections can be visualized within individual animals over time, without requiring euthanasia to determine the location and quantity of the pathogen. Optical imaging allows comprehensive examination of all tissues and organs, rather than sampling of sites previously known to be infected. In addition, the accuracy of inoculation into specific tissues can be directly determined prior to carrying forward animals that were unsuccessfully inoculated throughout the entire experiment. Variability between animals can be controlled for, since imaging allows each animal to be followed individually. Imaging has the potential to greatly reduce animal numbers needed because of the ability to obtain data from numerous time points without having to sample tissues to determine pathogen load3-4.
This protocol describes methods to visualize infections in live animals using bioluminescence imaging for recombinant strains of bacteria expressing luciferase. The click beetle (CBRLuc) and firefly luciferases (FFluc) utilize luciferin as a substrate5-6. The light produced by both CBRluc and FFluc has a broad wavelength from 500 nm to 700 nm, making these luciferases excellent reporters for the optical imaging in living animal models7-9. This is primarily because wavelengths of light greater than 600 nm are required to avoid absorption by hemoglobin and, thus, travel through mammalian tissue efficiently. Luciferase is genetically introduced into the bacteria to produce light signal10. Mice are pulmonary inoculated with bioluminescent bacteria intratracheally to allow monitoring of infections in real time. After luciferin injection, images are acquired using the IVIS Imaging System. During imaging, mice are anesthetized with isoflurane using an XGI-8 Gas Anethesia System. Images can be analyzed to localize and quantify the signal source, which represents the bacterial infection site(s) and number, respectively. After imaging, CFU determination is carried out on homogenized tissue to confirm the presence of bacteria. Several doses of bacteria are used to correlate bacterial numbers with luminescence. Imaging can be applied to study of pathogenesis and evaluation of the efficacy of antibacterial compounds and vaccines.

Methods for bioluminescence imaging of bacterial infections in living animals are decribed. Pathogens are modified to express luciferase allowing optical whole body imaging of infections in live animals. Animal models can be infected with luciferase expressing pathogens and the resulting course of disease visualized in real-time by bioluminescence imaging.

마우스의 이미지 세균 감염에 루시페라제를 사용하여

Imaging is a valuable technique that can be used to monitor biological processes.  In particular, the presence of cancer cells, stem cells, specific ...

연구

면역학 및 감염병학

Application of a Mouse Ligated Peyer&#x2019;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed to them and occasionally to pathogens. The gut-associated lymphoid tissue (GALT) play a key role for induction of the mucosal immune response to these microbes1, 2. To initiate the mucosal immune response, the mucosal antigens must be transported from the gut lumen across the epithelial barrier into organized lymphoid follicles such as Peyer's patches. This antigen transcytosis is mediated by specialized epithelial M cells3, 4. M cells are atypical epithelial cells that actively phagocytose macromolecules and microbes. Unlike dendritic cells (DCs) and macrophages, which target antigens to lysosomes for degradation, M cells mainly transcytose the internalized antigens. This vigorous macromolecular transcytosis through M cells delivers antigen to the underlying organized lymphoid follicles and is believed to be essential for initiating antigen-specific mucosal immune responses. However, the molecular mechanisms promoting this antigen uptake by M cells are largely unknown. We have previously reported that glycoprotein 2 (Gp2), specifically expressed on the apical plasma membrane of M cells among enterocytes, serves as a transcytotic receptor for a subset of commensal and pathogenic enterobacteria, including Escherichia coli and Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium), by recognizing FimH, a component of type I pili on the bacterial outer membrane 5. Here, we present a method for the application of a mouse Peyer's patch intestinal loop assay to evaluate bacterial uptake by M cells. This method is an improved version of the mouse intestinal loop assay previously described 6, 7. The improved points are as follows: 1. Isoflurane was used as an anesthetic agent. 2. Approximately 1 cm ligated intestinal loop including Peyer's patch was set up. 3. Bacteria taken up by M cells were fluorescently labeled by fluorescence labeling reagent or by overexpressing fluorescent protein such as green fluorescent protein (GFP). 4. M cells in the follicle-associated epithelium covering Peyer's patch were detected by whole-mount immunostainig with anti Gp2 antibody. 5. Fluorescent bacterial transcytosis by M cells were observed by confocal microscopic analysis. The mouse Peyer's patch intestinal loop assay could supply the answer what kind of commensal or pathogenic bacteria transcytosed by M cells, and may lead us to understand the molecular mechanism of how to stimulate mucosal immune system through M cells.

Application of a Mouse Ligated Peyer&amp;#8217;s Patch Intestinal Loop Assay to Evaluate Bacterial Uptake by M cells

M cells in a specialized follicle-associated epithelium covering Peyer&#x2019;s patches play an important role for the mucosal immunosurveillance in gut-associated lymphoid tissue. Here we described the evaluation method for bacterial transcytosis by M cells in vivo. This method provides a method to understand M-cell function in the immune system.

마우스의 응용은 M 세포에 의해 박테리아 이해를 평가하는 Peyer의 패치 장 루프 분석 출혈도 잡았

The inside of our gut is inhabited with enormous number of commensal bacteria. The mucosal surface of the gastrointestinal tract is continuously exposed ...

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

오버레이 분석을 사용하여 성적으로 폐렴 구균 박테리오신에 대한 세균의 생산 및 감도를 측정하는

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Pairwise Growth Competition Assay for Determining the Replication Fitness of Human Immunodeficiency Viruses

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to extrapolate viral replication fitness, ranging from the number of viral particles per infectious unit, growth rate in cell culture, and relative fitness derived from multiple-cycle growth competition assays. Growth competition assays provide a particularly sensitive measurement of fitness since the viruses are competing for cellular targets under identical growth conditions. There are several experimental factors to consider when conducting growth competition assays, including the multiplicity of infection (MOI), sampling times, and viral detection and fitness calculation methods. Each factor can affect the end result and hence must be considered carefully during the experimental design. The protocol presented here includes steps from constructing a new recombinant HIV-1 clone to performing growth competition assays and analyzing the experimental results. This protocol utilizes experimental parameter values previously shown to yield consistent and robust results. Alternatives are discussed, as some parameters need to be adjusted according to the cell type and viruses being studied. The protocol contains two alternative viral detection methods to provide flexibility as the availability of instruments, reagents and expertise varies between laboratories.

Growth competition between nearly isogenic viruses provides a sensitive measurement for determining relative replication fitness. The protocols described here include the construction of recombinant HIV-1 clones, virus propagation and growth competition and analysis methods optimized to yield sensitive and consistent results.

인간 면역 결핍 바이러스의 복제 피트니스를 결정하기위한 인접 쌍 성장 경쟁 분석

In vitro fitness assays are essential tools for determining viral replication fitness for viruses such as HIV-1. Various measurements have been used to ...

Application of Long-term cultured Interferon-&#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is controlled up to 95 % of the T cells generated during the expansion phase are eliminated (i.e., contraction phase) and memory T cells remain, sometimes for a lifetime. In humans, two functionally distinct subsets of memory T cells have been described based on the expression of lymph node homing receptors. Central memory T cells express C-C chemokine receptor 7 and CD45RO and are mainly located in T-cell areas of secondary lymphoid organs. Effector memory T cells express CD45RO, lack CCR7 and display receptors associated with lymphocyte homing to peripheral or inflamed tissues. Effector T cells do not express either CCR7 or CD45RO but upon encounter with antigen produce effector cytokines, such as interferon-&#947;. Interferon-&#947; release assays are used for the diagnosis of bovine and human tuberculosis and detect primarily effector and effector memory T cell responses. Central memory T cell responses by CD4+ T cells to vaccination, on the other hand, may be used to predict vaccine efficacy, as demonstrated with simian immunodeficiency virus infection of non-human primates, tuberculosis in mice, and malaria in humans. Several studies with mice and humans as well as unpublished data on cattle, have demonstrated that interferon-&#947; ELISPOT assays measure central memory T cell responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are cultured in decreasing concentration of antigen for 10 to 14 days (long-term culture), allowing effector responses to peak and wane; facilitating central memory T cells to differentiate and expand within the culture.

Application of Long-term cultured Interferon-&amp;#947; Enzyme-linked Immunospot Assay for Assessing Effector and Memory T Cell Responses in Cattle

Long-term cultured interferon-&#947; enzyme-linked immunospot assay is used as a measure of central memory responses and correlates with protective anti-mycobacterial vaccine responses. With this assay, peripheral blood mononuclear cells are stimulated with mycobacterial antigens and interleukin-2 for 14 days, enabling differentiation and expansion of central memory T cells.

소에 이펙터 및 메모리 T 세포 반응을 평가하기위한 장기 배양 인터페론-γ 효소 링크 된 Immunospot 분석의 응용 프로그램

Effector and memory T cells are generated through developmental programing of na&#239;ve cells following antigen recognition. If the infection is ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence factors, which can subvert and manipulate key host functions. The study of host/pathogen interactions is therefore extremely important to understand bacterial infections and develop alternative strategies to counter infectious diseases. This approach however, requires the development of new high-throughput assays for the unbiased, automated identification and characterization of bacterial virulence determinants. Here, we describe a method for the generation of a GFP-tagged mutant library by transposon mutagenesis and the development of high-content screening approaches for the simultaneous identification of multiple transposon-associated phenotypes. Our working model is the intracellular bacterial pathogen Coxiellaburnetii, the etiological agent of the zoonosis Q fever, which is associated with severe outbreaks with a consequent health and economic burden. The obligate intracellular nature of this pathogen has, until recently, severely hampered the identification of bacterial factors involved in host pathogen interactions, making of Coxiella the ideal model for the implementation of high-throughput/high-content approaches.

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Coxiella burnetii is an obligate intracellular Gram-negative bacterium responsible for the zoonotic disease Q fever. Here we describe methods for the generation of Coxiella fluorescent transposon mutants as well as the automated identification and analysis of the resulting internalization, replication and cytotoxic phenotypes.

세대와의 멀티 표현형 높은 콘텐츠 상영<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; 트랜스포존 돌연변이

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

세균 포자 발아 동안 코어 텍스 조각 검출

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of antibiotics and other secondary metabolites. Streptomyces coelicolor is a well-characterized, non-pathogenic species that is amenable to a variety of analyses in the lab. The phenotyping methods described here use S. coelicolor as a model streptomycete; however, the methods are applicable to all members of this large genus as well as some closely related actinomycetes. Phenotyping is necessary to characterize new species of Streptomyces identified in the environment, and it is also a vital first step in characterizing newly isolated mutant strains of Streptomyces. Proficiency in phenotyping is important for the many new researchers who are entering the field of Streptomyces research, which includes the study of bacterial development, cell division, chromosome segregation, and second messenger signaling. The recent crowdsourcing of antibiotic discovery through the isolation of new soil microbes has resulted in an increased need for training in phenotyping for instructors new to the field of Streptomyces research and their college or high school students. This manuscript describes methods for bacterial strain propagation, storage, and characterization through visual and microscopic examination. After reading this article, new researchers (microbiology education laboratories and citizen scientists) should be able to manipulate Streptomyces strains and begin visual characterization experiments.

Visual and Microscopic Evaluation of Streptomyces Developmental Mutants

Here we present protocols for novice researchers to initiate phenotyping for the pharmacologically important bacterial genus Streptomyces.

Streptomyces 발달 돌연변이의 영상 및 현미경 평가

Streptomycetes are filamentous soil bacteria belonging to the phylum Actinobacteria that are found throughout the world and produce a wide array of ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing activity by assessing the ability of antibodies in serum to bind to bacteria and activate complement. This complement activation results in the lysis and killing of the target bacteria. These assays are valuable because they go beyond quantifying antibody production to elucidate the biological functions that these antibodies have, allowing researchers to study the role that antibodies may play in preventing infection. SBAs have been used to study immune responses for many human pathogens, but there is no widely accepted methodology for Shigella at present. Historically, SBAs have been very labor-intensive, requiring many time-consuming steps to accurately quantify surviving bacteria. This protocol describes a simple, robust, and high-throughput assay that measures functional antibodies specific for Shigella in serum in vitro. The method described here offers many advantages over traditional SBAs, including the use of frozen bacterial stocks, 96 well assay plates, a micro-culture system, and automated colony-counting. All of these modifications make this assay less labor-intensive and more high-throughput. This protocol is simpler and faster to perform than traditional SBAs while still using simple technologies and readily available reagents. The protocol has been successfully applied in multiple independent laboratories and the assay is robust and reproducible. The assay can be used to assess immune responses in pre-clinical as well as clinical studies. Quantifying shigellacidal antibody titers both before and after antigen exposure (either by immunization or infection) allows for a broader understanding of how functional antibody responses are generated and their contribution to protective immunity. The development of this standardized, well-characterized assay may greatly facilitate Shigella vaccine design.

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Here we present a protocol to measure Shigellacidal activity of antibodies in serum. Serum is mixed with bacteria and exogenous complement, incubated, and the reaction mixture is plated on agar plates. Viable bacteria form colonies which are counted, using an automated colony enumerator, and used to determine the bactericidal titer.

높은 처리량 Shigella-특정 살 균 시험

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental procedure in which phagocytic cells are co-cultured with bacterial units. The immune cells will phagocytose and kill the bacterial cultures in a complement-dependent manner. The efficiency of the immune-mediated cell killing is dependent on a number of factors and can be used to determine how different bacterial cultures compare with regard to resistance to cell death. In this way, the efficacy of potential immune-based therapeutics can be assessed against specific bacterial strains and/or serotypes. In this protocol, we describe a simplified OPKA that utilizes basic culture conditions and cell counting to determine bacterial cell viability after co-culture with treatment conditions and HL-60 immune cells. This method has been successfully utilized with a number of different pneumococcal serotypes, capsular and acapsular strains, and other bacterial species. The advantages of this OPKA protocol are its simplicity, versatility (as this assay is not limited to antibody treatments as opsonins), and minimization of time and reagents to assess basic experimental groups.

This opsonophagocytic killing assay is used to compare the ability of phagocytic immune cells to respond to and kill bacteria based on different treatments and/or conditions. Classically, this assay serves as the gold&#160;standard for assessing effector functions of antibodies raised against a bacterium as opsonin.

Opsonophagocytic 살해 분석 결과 세균성 병원 체에 대 한 면역학 응답을 평가 하

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...