이 작품은 PD에 PD로 미국 심장 협회 (American Heart Association) 상 13SDG14500046, 지속 가능한 에너지 교육 및 연구 센터 상 (테네시 Univ.의)에 의해 지원되며, JM에 대한 의사의 의학 교육 및 연구 재단 (테네시 Univ.의)에 의해 수상했다 그의 떨고 인큐베이터, 탁상 원심 분리기, 웨스턴 블롯 분석 장비의 사용 에릭 T. Boder (테네시 Univ.의), 저자는 spheroplasts에 분열 효모를 변환하는 프로토콜 캐롤라인 Leplante (. 예일 대학교를) 감사를위한 센터 자신의 초 원심 분리기의 사용 환경 생명 공학 명 (대학 테네시), 효모 항체 귄터 다음 세대 (그라츠 대학 기술, 오스트리아.) 기술 지원 산부인과 명 (대학 테네시 의료 센터)의 부서의 직원 .

1. (분열) 효모 세포에서 지질 방울을 분리 효모 사카로 마이 세스 세레 비시 애의 신진 인기 모델 생물에서 물방울의 분리는 다음 프로토콜 6과 거의 동일합니다. 준비의 차이가 설명되어 있습니다. 1. 성장 효모 세포 <ol><li> 미디어를 준비합니다. 유리 병 또는 배양 플라스크에 dH보다 2 O 리터당 YE5S 분말 36g을 결합합니다. 미디어의 약 2 L이 필요합니다. 20 분 동안 121 ° C에서 미디어를 압력솥. 미디어가 실내 온도까지 냉각 할 수 있습니다. S.에 대한 사카로 마이 세스 세레 비시 애는 YPD와 YE5S를 교체합니다. </li><li> 무균 기술을 사용하여 250 ㎖의 배양 플라스크에 냉각 YE5S 미디어의 10 ~ 20 ㎖를 놓습니다. 멸균 나무 막대기를 사용하거나 동등한 한천 플레이트에서 효모 세포의 소량의 매체를 접종한다. 세포가 30 ℃에서 원하는 광학 밀도로 성장하자 에서 광학 밀도를 측정분광 광도계를 사용하여 595 ㎚의 파장. </li><li> 2.8 L 플라스크에 남아있는 용지를 넣습니다. 진탕 배양기에서 세포 성장하는 동안 적절한 혼합을 보장하기 위해 미디어 2.8 L 당 플라스크의 1 더 이상으로보다 L을 사용합니다. 젖은 세포의 최종 수율은 프로테옴 lipidomic 분석을 위해 충분한 지질 방울을 취득 할 수 있도록 약 10 g으로한다. </li><li> 각 단계 1.1으로 제조 하였다 미디어 1 L를 갖는 2.8 L 플라스크에 1.2 단계에서 세포를 소개합니다. </li><li> 30 ° C에서 원하는 농도로 세포를 성장 </li><li> 세포가 지질 방울을 가지고 있는지 확인합니다. 세포의 준비 1 ㎖. 샘플의 광학 밀도 (OD)를 측정한다. 샘플 세포의 OD 당 에탄올에 BODIPY 503분의 493의 100 ㎜ 주식의 0.1 ML을 추가합니다. 유리 슬라이드와 유리 커버 슬립 사이의 샘플 3 μL를 놓습니다. GFP 필터 (그림 1A)과 형광 현미경으로 시각화. </li><li> 4 &amp; #에서 단계 1.5에서 세포 펠렛176, C 10 분 동안 3,800 XG에. 원심 분리기 튜브의 용량에 따라 일괄 적으로 작동한다. </li><li> YE5S 미디어를 붓고 소르비톨 EMM + 600 mm의 버퍼로 세포를 씻어. 소르비톨은 삼투 지원을 제공합니다. </li><li> 멸균 50 ML의 원심 분리기 튜브에 세포를 전송하고 10 분 동안 2,000 XG에서 4 ° C에서 세포 펠렛. 뜨는을 제거합니다. 젖은 세포를 무게. 셀 그램 당 (EMM + 600 mM의 소르비톨) 버퍼의 2 ml의 세포를 Resuspend. </li></ol> 2. spheroplasts 이후의 용해에 분열 효모 세포를 변환 <ol><li> ) 효모 세포 용해 효소를 5 mg의 1을 각각 추가, 2) 효모 트리코더마 harzianum 그램 당 단계 1.9에 무게했다 젖은 세포에서 효소를 용균. S.에 대한 사카로 마이 세스 세레 비시 애는 Zymolyase 같은 양의 효소를 증가. </li><li> 60 분 동안 100 rpm으로 흔들어 부드러운에서 30 ° C에서 세포를 품어. </li><li> spheroplasts 지질 박사가 있는지 확인하십시오oplets. 단계 1.6 (그림 1B)를 반복하여. </li></ol> 3. 밀도 구배 원심 분리 <ol><li> 5 분 2,000 XG에서 4 ° C에서 원심 분리하여 spheroplasts 펠렛. </li><li> 조심스럽게 플라스틱 전송 피펫을 사용하여 상층 액을 제거합니다. </li><li> 조심스럽게 얼음 차가운 10 mM 트리스 - 염산, 소르비톨 600 ㎜, 200 μM EDTA와 펠렛 spheroplasts을 재현 탁. spheroplasts 매우 깨지기 있음을 알아 두셔야합니다. </li><li> 3.1 단계에서와 동일한 설정을 사용하여 다시 spheroplasts 펠렛. 조심스럽게 상층 액을 제거하고 2 ㎖ / g-세포의 농도로 12 % 피콜있는 플라스틱 전송 피펫, 10 mM 트리스 - 염산, 200 μM EDTA를 사용 spheroplasts를 재현 탁. </li><li> 유리 균질에 재현 탁 spheroplasts를 전송하고 부드럽게 유리 균질의 느슨한 피팅 유 봉, 얼음에 20 ~ 30 스트로크를 균질화. </li><li> 원심 분리기 튜브에 용해 spheroplasts를 전송하고 같은 할머니와 오버레이12 % 피콜, 10 mM 트리스 - 염산, 및 200 μM의 EDTA 완충액 LUME. 각각의 관은 3 분의 2 가득 차있는 것을 사용하는 원심 분리기 튜브의 수를 선택합니다. </li><li> SW28 로터 또는 이에 상응하는 1.5 시간 동안 10 만 XG에 4 ° C에서 원심 분리기. 정지 (로터 감속 = 0)에 해안에 회 전자를 허용합니다. </li><li> 부드럽게 피펫 또는 구부러진 파스퇴르 피펫을 사용하여 새로운 원심 분리 관 (들)에 방울을 포함하는 상위 떠있는 하얀 층 (그림 2A)를, 전송할 수 있습니다. 이 원심 관의 약 3 분의 1을 채우도록 시료에 충분한 12 % 피콜 부피, 10 mM 트리스 - 염산, 및 200 μM의 EDTA 버퍼를 추가. </li><li> 새로운 원심 분리 관 (들)의 샘플 (들)의 상단에 해당하는 8 % 피콜의 양, 10 MM 트리스 - 염산, 200 μM의 EDTA 버퍼를 추가합니다. 이 첨가 후, 튜브는 전체 3 분의 2이어야 버퍼. </li><li> SW28 로터 또는 동급에서 1 시간 동안 10 만 XG에 4 ° C에서 원심 분리기. 정지 해안에 회 전자를 허용 (ROTOR 감속 = 0). </li><li> 부드럽게 피펫 또는 구부러진 파스퇴르 피펫을 사용하여 새로운 원심 분리 관 (들)에 방울을 포함 할 최고 떠있는 하얀 층 (그림 2B)를 전송합니다. 이 원심 관의 약 3 분의 1을 채우도록 샘플, 소르비톨 8 % 피콜, 10 mM 트리스 - 염산, 및 200 μM의 EDTA 완충액을 600 mM의 추가. </li><li> 새로운 원심 분리 관 (들)의 샘플 (들)의 정상에, 소르비톨 10 MM 트리스 - 염산을 250 ㎜의 동등한 볼륨을 추가, 200 μM의 EDTA 버퍼. 이 첨가 후, 튜브는 전체 3 분의 2이어야 버퍼. </li><li> SW28 로터 또는 동급에서 1 시간 동안 10 만 XG에 4 ° C에서 원심 분리기. 정지 (로터 감속 = 0)에 해안에 회 전자를 허용합니다. </li><li> 투석 튜브에 만 지질 방울과 결합 단백질을 포함하고 피콜을 제거하기 위해 10 mM 트리스 - 염산과 200 μM EDTA 버퍼에 O / N을 dialyze한다 최고 백색 층 (그림 2C)를 전송합니다. </li></ol><p클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. 인간의 태반 융모 세포에서 지질 방울을 분리 태반은 싱글 임신 전에 용어의 자발적인 노동의 발병에 선택적 제왕 절개 배달을 겪고있는 건강한 여성에서 수집되었다. 주제는 태반의 수집에 대한 서면 동의서를 주었다. 태반의 수집 및 후속 사용은 녹스빌 기관 검토위원회의 테네시 의학 테네시 대학 대학원 대학 (각각 # 1 8757B 및 # 3338)에서 승인을 수행 하였다. 1. 인간의 태반 융모 세포를 분리 프로토콜의 1 부 Petroff 등. (26)에 의해 이전에 발표 된 프로토콜의 변형입니다 솔루션 다음과 같은 준비 <ul><li> 염화나트륨 (1 L) : 1 L 용액을 수득 dH보다 2 O에 9g의 NaCl (M 58.4 g / 몰)을 용해. 소독 필터 (0.2; μm의 막). </li><li> 배 행크의 균형 소금 솔루션 (10X HBSS) (1 L) : 4g의 KCl (M 74.5 g / 몰), 0.6 g의 KH 2 PO 4 (M 136.086 g / 몰), 80g의 NaCl (M 58.44 g / 몰) 10g의 D-글루코오스 (M 180.16 g / mol)의 2 HPO 4 (M 141.96 g / mol)의 NA. 1 L 용액을 수득 dH보다 2 O에서 각각의 성분을 용해. 소독 필터 (0.2 ㎛ 멤브레인). </li><li> 효소 소화 버퍼 (0.6 ㎖) : 3.3 ml의 7.5 % 나 Biscarbonate, 17.5 ㎖의 1 M HEPES 및 266.1 ㎖의 dH보다 2 O와 70 ㎖의 10 배 HBSS를 결합, 소독 필터 (0.2 ㎛의 막). 4 ℃에서 보관 </li><li> DNA 분해 효소 I : 그냥 사용하기 전에, DNA 분해 효소의 유리 병에 5 ㎖ 멸균 0.9 %의 NaCl을 추가합니다. -20 ° C에서 사용하거나 보관 할 때까지 얼음에 보관 </li></ul><ol><li> 해부를위한 준비 태반 <ol><li> 인간 태반 가능한 배달 시간에 가까운 과정을 구합니다. 이러한 태반을 수송하는 쿨러​​로 밀폐 용기를 사용합니다. 때 손을 항상주의하십시오링 인간의 생물학적 물질. </li><li> 생물학적 안전 후드에서 멸균 고압 증기 멸균 용기에 태반을 전송하고, 신중하게 멸균 0.9 % 염화나트륨 (염분) 용액을 이용하여 태반과 세포막에서 혈액을 씻어. 액체 생물학적 폐기물로 1 L 비이커에 피 묻은 염분을 폐기하십시오. </li><li> 부드러운면이 위를 향하고 탯줄 베어링과, 무균 영역에서 태반을 놓습니다. 샤프, 미세 포인트 가위와 집게로 태아 막 탯줄을 제거합니다. </li><li> 산모의 표면 (거친 표면)이 위로 오도록 태반을 뒤집습니다. 위에 놓인 기초 판의 조직, 표면으로부터 약 3mm를 제거합니다. </li></ol></li><li> 태반을 해부 <ol><li> 융모 판을 피하고 한 번에 하나의 떡잎을 해부하다. 식염수 250 ㎖의 비이커에 융모 조직을 수집합니다. </li><li> 액체 폐기물의 1 L 비이커를 사용하여 집게로 소용돌이 치는 0.9 % NaCl로 별도의 비커에 조직을 여러 번 씻어. </li><li> 150mm 배양 접시에 한 번에 한 자엽을 전송. 집게로 잡고 페트리 접시에 배에서 면도날로 조직을 다 쳤어요. 0.9 %의 NaCl을 포함하는 별도의 비커에 스크랩 한 조직을 놓습니다. 모든 조직의 조각에 대해 반복합니다. </li><li> 세포 분리 체에 조직의 작은 부분을 전송하고 용출액이 명확해질 때까지 광범위하게 0.9 % NaCl로 씻어냅니다. 모든 조직에 대해이 단계를 반복합니다. </li><li> 세포 분리 체에 스크랩 한 조직을 세척 한 후 물기와 무게를 배수. 이 시점에서 조직을 DMEM에서 4 ° C에서 멸균 삼각 플라스크에 O / N을 저장 될 수있다. </li></ol></li><li> 태반 조직의 효소 소화 <ol><li> 데워진 효소 희석액 100 ㎖, 1 ㎖ DNase의 I 및 20 ㎖의 2.5 % 트립신 10X : 티슈 소화 혼합물을 제조한다. </li><li> 500 ㎖ 멸균 삼각 플라스크에 총 수집 된 조직 (일반적으로 250-300 g)를에서 60g을 전송, 조직을 나눈다. </li><l난&gt; 조직을 포함하는 삼각 플라스크에 조직 소화 혼합물을 추가하고 150 rpm에서 45 분 동안 진탕에서 37 ° C에서 알을 품다. </li></ol></li><li> 해리 세포를 수집 <ol><li> 조직이 정착 될 때까지 처음 45 분 해리 후, 경사에서 소화 플라스크를 설정합니다. </li><li> 해리되지 않은 조직을 수집하지 않도록주의하면서 상층 액을 수집합니다. 수집 된 상층 액에 HBSS의 동일한 금액을 추가하고 멸균 15 ML의 원심 분리기 튜브로 전송할 수 있습니다. 해리되지 않은 조직의 추가 부분과, 해리되지 않은 조직과 단계 3.2부터 절차를 반복합니다. </li><li> 15 분 1,000 XG에서 4 ° C에서 균질를 원심 분리기. </li><li> 각 배치의 경우, 원심 분리 다음, 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음. 태반 융모 세포는 적혈구를 덮는, 펠릿의 흰 부분에 우세하다. </li><li> 세인트 융모 세포 (펠렛의 흰색 부분)로 이동50 ㎖에게 원뿔 원심 분리 관을 erile 얼음 계속. </li><li> 세 소화 단계에서 세포를 수집 한 후, 멸균 50 ㎖ 원추형 원심 분리 관의 상단에 삽입 100 μM 나일론 세포 여과기를 이용하여 현탁액을 고를. 세포 현탁액의 여과 속도가 느려 경우, 튜브 내에서 진공을 그립니다 필터를 위로 들어 올립니다. </li><li> 10 분 1,000 XG에 4 ° C에서 원심 분리기. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 제거합니다. </li></ol></li></ol> 2. 태반 융모 세포를 균질화 <ol><li> 분리 과정을 시작하기 전에, 20 MM 트리스 - 염산, 산도 7.4, 1 mM의 EDTA를 포함 저장성 용해 중간 (HLM) 50 ㎖를 준비합니다. 사용 직전에 HLM에 단백질 분해 효소 억제제를 추가하고 얼음에 매체를 유지합니다. </li><li> 생물학적 안전 후드에서, 세포에 빙냉 HLM의 4 배 세포 펠렛 부피를 추가한다. 부드럽게하고 철저하게 세포를 피펫 팅하여 세포를 재현 탁 업10 ㎖ 피펫을 사용하여 D 다운. </li><li> 10 분 동안 얼음에 일시 중단 된 세포를 품어. </li><li> 얼음에 있어야 다운스 균질에 세포를 전송합니다. 천천히 균질의 헐렁한와 유 봉, 20-25 부드러운 스트로크를 적용하여 세포를 균질화. </li><li> 원심 분리기는 10 분 동안 3,000 XG에 4 ° C에서 세포 용 해물은 손상되지 않은 세포, 세포 파편과 핵을 제거합니다. </li><li> 상층 액을 수집하고 SW28 튜브 (25,000 XG에서 원심 분리 할 수​​있는 대안)에 전송할 수 있습니다. 미토콘드리아를 제거하는 20 분 동안 25,000 XG에 4 ° C에서 원심 분리기. </li></ol> 3. 초 원심 분리에 의해 지질 방울을 분리 <ol><li> 50 100 밀리미터 탄산나트륨 (M 106g / 몰) 완충액 (pH 11.5)의 ㎖ 및 50 ㎖의 60 % 자당 (W / W) 솔루션을 준비합니다. 사용 직전에 탄산나트륨 버퍼에 프로테아제 억제제를 추가하고 얼음에 보관. </li><li> 조정, 50 ㎖ 원심 관에 단계 2.6에서 뜨는 수집SW28 로터 또는 이와 동등한에 대한 초 원심 분리기 튜브의 바닥에 자당 및 전송의 20 %. ~ 빙냉 100 mM의 탄산나트륨 완충액 (pH 11.5) 10 ㎖ 및 튜브를 채우기 위해 빙냉 HLM의 0.5-1 ml의 오버레이와 밀도를 조정 상등액. </li><li> SW28 스윙 버킷 로터를 사용하여 45 분 동안 130,000 XG에 4 ° C에서 원심 분리기. 정지 (로터 감속 = 0)에 해안에 회 전자를 허용합니다. </li><li> 10 % 자당에 조정 SW41Ti 로터, 또는 동등의 13.2 ML 초 원심 분리기 튜브의 바닥으로 전송, 부동 층을 수집합니다. 오버레이 밀도 약 5 빙냉 100 mM의 탄산나트륨 완충액 (pH 11.5) ml의 빙냉 HLM 0.5 ml의 상등액을 조정. </li><li> SW41Ti 스윙 버킷 로터를 사용하여 60 분 동안 274,000 XG에 4 ° C에서 원심 분리기. (로터 감속 = 0) 지질 방울 층의 혼란을 최소화하기 위해 정지 해안에 회 전자를 허용합니다. </li><li> 조심스럽게 들어있는 최고 부유 계층 (그림 2D)를 수집1 ㎖ 피펫 단계를 반복 3.4과 지질 방울. </li><li> SW41Ti 스윙 버킷 로터를 사용하여 30 분 동안 274,000 XG에 4 ° C에서 원심 분리기. 정지 (로터 감속 = 0)에 해안에 회 전자를 허용합니다. </li><li> 조심스럽게 100 μL의 HLM을 포함하는 세 1.5 ML 튜브에 구부러진 파스퇴르 피펫과 지질 방울을 포함하는 상위의 흰색 부동 층을 수집합니다. </li></ol> 특성화 지질 방울 분획 (프로토콜 1, 2) 지질 방울 부분의 복구 및 순도는 빛이나 전자 현미경과 함께 서양의 얼룩에 의해 확인 될 수있다. 또 다른 원심 분리 단계 후에 분액 수집 될 수 있고, 정화 효율을 결정하기 위해 유지. 웨스턴 블 롯팅에서, t에 다른 막 분획에 지질 방울을 비교보다는 전체 세포 용 해물의 등가를 나타내는 지질 액적 분획의 양을 비교하는 것이 더 적절하다총 단백질 함량의 24 그는 기초.

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L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+proteins+associated+with+lipid+droplets+of+basal+and+lipolytically+stimulated+3T3-L1+adipocytes.">Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes.</a> J. Biol. Chem. 279, 46835-46842 (2004).</li><li>Liu, P. S., Ying, Y. S., Zhao, Y. M., Mundy, D. I., Zhu, M. F., Anderson, R. G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chinese+hamster+ovary+K2+cell+lipid+droplets+appear+to+be+metabolic+organelles+involved+in+membrane+traffic.">Chinese hamster ovary K2 cell lipid droplets appear to be metabolic organelles involved in membrane traffic.</a> J. Biol. Chem. 279, 3787-3792 (2004).</li><li>Fujimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+major+proteins+in+the+lipid+droplet-enriched+fraction+isolated+from+the+human+hepatocyte+cell+line+HuH7.">Identification of major proteins in the lipid droplet-enriched fraction isolated from the human hepatocyte cell line HuH7.</a> Biochim. Biophys. Acta. , 47-59 (2004).</li><li>Sato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+profiling+of+lipid+droplet+proteins+in+hepatoma+cell+lines+expressing+hepatitis+C+virus+core+protein.">Proteomic profiling of lipid droplet proteins in hepatoma cell lines expressing hepatitis C virus core protein.</a> J. Biochem. 139, 921-930 (2006).</li><li>Umlauf, E., Csaszar, E., Moertelmaier, M., Schuetz, G. J., Parton, R. G., Prohaska, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+stomatin+with+lipid+bodies.">Association of stomatin with lipid bodies.</a> J. Biol. Chem. 279, 23699-23709 (2004).</li><li>Zhang, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteome+of+skeletal+muscle+lipid+droplet+reveals+association+with+mitochondria+and+apolipoprotein+A-I.">Proteome of skeletal muscle lipid droplet reveals association with mitochondria and apolipoprotein A-I.</a> J. Proteome Res. 10, 4757-4768 (2011).</li><li>Wu, C. C., Howell, K. E., Neville, M. C., Yates, J. R., McManaman, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+reveal+a+link+between+the+endoplasmic+reticulum+and+lipid+secretory+mechanisms+in+mammary+epithelial+cells.">Proteomics reveal a link between the endoplasmic reticulum and lipid secretory mechanisms in mammary epithelial cells.</a> Electrophoresis. 21, 3470-3482 (2000).</li><li>Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+lipid+droplets+from+cells+by+density+gradient+centrifugation.">Isolation of lipid droplets from cells by density gradient centrifugation.</a> Curr. Protoc. Cell Biol. , 3.15.1-3.15.12 (2005).</li><li>Long, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet+de+novo+formation+and+fission+are+linked+to+the+cell+cycle+in+fission+yeast.">Lipid droplet de novo formation and fission are linked to the cell cycle in fission yeast.</a> Traffic. 13, 705-714 (2012).</li><li>Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+term+human+trophoblast+cells.">Isolation and culture of term human trophoblast cells.</a> Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).</li><li>Cho, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+mouse+Prp19p+as+a+lipid+droplet-associated+protein+and+its+possible+involvement+in+the+biogenesis+of+lipid+droplets.">Identification of mouse Prp19p as a lipid droplet-associated protein and its possible involvement in the biogenesis of lipid droplets.</a> J. Biol. Chem. 282, 2456-2465 (2007).</li><li>Ding, Y. B., Wu, Y. B., Zeng, R., Liao, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+profiling+of+lipid+droplet-associated+proteins+in+primary+adipocytes+of+normal+and+obese+mouse.">Proteomic profiling of lipid droplet-associated proteins in primary adipocytes of normal and obese mouse.</a> Biochim. Biophys. Acta. 44, 394-406 (2012).</li><li>Jagerstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+interact+with+mitochondria+using+SNAP23.">Lipid droplets interact with mitochondria using SNAP23.</a> Cell Biol. Int. 33, 934-940 (2009).</li><li>Xu, N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+FATP1-DGAT2+complex+facilitates+lipid+droplet+expansion+at+the+ER-lipid+droplet+interface.">The FATP1-DGAT2 complex facilitates lipid droplet expansion at the ER-lipid droplet interface.</a> J. Cell Biol. 198, 895-911 (2012).</li><li>Ozeki, S., Cheng, J. L., Tauchi-Sato, K., Hatano, N., Taniguchi, H., Fujimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab18+localizes+to+lipid+droplets+and+induces+their+close+apposition+to+the+endoplasmic+reticulum-derived+membrane.">Rab18 localizes to lipid droplets and induces their close apposition to the endoplasmic reticulum-derived membrane.</a> J. Cell Sci. 118, 2601-2611 (2005).</li><li>Yang, H. Y., Galea, A., Sytnyk, V., Crossley, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlling+the+size+of+lipid+droplets:+lipid+and+protein+factors.">Controlling the size of lipid droplets: lipid and protein factors.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 24, 509-516 (2012).</li><li>Jacquier, N., Choudhary, V., Mari, M., Toulmay, A., Reggiori, F., Schneiter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplets+are+functionally+connected+to+the+endoplasmic+reticulum+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).</li><li>Pu, J., Ha, C. W., Zhang, S., Jung, J. P., Huh, W. K., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactomic+study+on+interaction+between+lipid+droplets+and+mitochondria.">Interactomic study on interaction between lipid droplets and mitochondria.</a> Protein Cell. 2, 487-496 (2011).</li><li>Shaw, C. S., Jones, D. A., Wagemakers, A. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+distribution+of+mitochondria+and+lipid+droplets+in+human+muscle+fibres.">Network distribution of mitochondria and lipid droplets in human muscle fibres.</a> Histochem. Cell Biol. 129, 65-72 (2008).</li><li>Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gregarious+lipid+droplet.">The gregarious lipid droplet.</a> J. Biol. Chem. 283, 28005-28009 (2008).</li><li>Brasaemle, D. L., Wolins, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Packaging+of+fat:+an+evolving+model+of+lipid+droplet+assembly+and+expansion.">Packaging of fat: an evolving model of lipid droplet assembly and expansion.</a> J. Biol. Chem. 287, 2273-2279 (2012).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

<html> 이 프로토콜 내에서 중요한 단계 배양 세포의 성장하는 동안 미디어 및 세포 밀도와 일치해야합니다. 세포 지질 방울들이 관련된 단백질이 세포가 배양 된 17되는 환경에 크게 의존한다는 점에서 독특합니다. 따라서, 세포가 성장되어있는 미디어와 세포의 밀도는 밀접 용해 전에 모니터링해야한다. 지질 방울의 단?...

세포의 지질 방울은 세포의 여러 기능을 제공 동적 세포 기관이다. 이들은 에너지로 변환하거나 인지질 합성을 위해 사용될 수있다 중성 지질, 스토리지 허브이다. 방울은 동맥 경화증, 비만과 관련된 대사 질환 등의 생리 학적 및 병리학 적 조건에서 중심 역할을하고, 또한 전염병 1,2. 또한, 그들은 바이오 디젤 연료에 대한 흥미로운 소스입니다. 지질 방울의 세포 역할에 대한 많은 정보가 광범위한 생물 3에서 정제 방울의 프로테옴 lipidomic 분석에서 얻을 수있다. 이 생명체는 박테리아 4,5, 효모 6-11 포함 12,13 식물, 14 선충, 그리고 15, 16 비행했다. 인간 대사 질환에서 지질 소적의 역할에 관심을 감안할 때, 액적 또한 배양 된 동물 세포에서 분리 된nimal 조직. 배양 세포주는 3T3-L1 지방 세포 (17), 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 K2 18 인간 hepatocyes 19,20 및 상피 세포 라인 (21)을 포함했다. 물방울이 고립되어있는 동물 조직 마우스 골격근 22 일 간 (23) 및 유 방 땀 샘 (23)를 포함했다. 전술 한 바와 같이, 대부분의 액적 분리 연구의 목표는 결합 계수 및 중립 및 인지질에 lipidomic 분석 프로테옴 분석을 수행하는 것이다. 중성 지질시기 - 지질 방울의 대부분의 수많은 구성 요소 - 대부분의 다른 세포 물질보다 밀도이며, 액적 분리 전통적 밀도 구배 원심 분리를 사용하여 수행되었다. 그 기술은 여기에 제시된 두 수험 공부의 중심이다. 이전 기술 6,24은 배양 분열 효모 세포에서 물방울의 분리의 시각적 표현으로 결합 및 수정및 noncultured 인간의 세포는 태반 조직에서 얻을. 목표는 액적 분리를위한 시작점으로서이 크게 다른 세포 유형을 선택하여이 기술의 광범위한 응용을 보여주는 것이다. 이 기술은 대부분의 생물에서 물방울을 분리하고자하는 사람들에게 유용하게 쓰일 수있을 것이다. 프로토콜 하나는 진핵 세포 분열 (25) 중에 액적 형성을 관찰하기위한 모델로서 이용되어왔다 분열 효모 Schizosaccharomyces 용의 pombe로부터 지질 방울의 분리를 설명한다. 신진 효모 사카로 마이 세스 세레 비시 애 지질 방울 생물학 연구의 모델 생물로 광범위하게 사용되어왔다. 프로토콜 1 생물과 준비의 차이 모두에 적용이 강조된다. 프로토콜 2는 인간의 장기 태반에서 얻을 수 차례에 태반 융모 세포에서 지질 방울의 분리에 대해 설명합니다.용어 태반의 수집은 안전하고 윤리적으로 지질 방울의 상당한 숫자가 포함 쉽게 사용할 수 인체 조직 26, 200-250 g을 수득 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 이것은 물방울이 배양 된 세포에서 발생한 높은 진핵 가장 지질 액적 분리 작업 대조적이다. 그 연구에서, 지방산은 종종 중성 지질 따라서 방울의 성장의 합성을 촉진하는 문화에 추가됩니다. 이 지질 방울는 태반 조직의 기본 조건이 형성되어 여기에 작업 대조적이다. 지질 방울 분획의 순도는 소기관 마커 항체를 사용하여 웨스턴 블롯 분석에 의해 결정된다. 이 두 프로토콜은 다음, 프로테옴 lipidomic 분석에 적합한 지질 방울 분수를 얻을 것입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="802">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">PROTOCOL #1:&#160;</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">1.Growing yeast cells and converting to spheroplasts</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Edinburgh Minimal Media (EMM)</td>
			<td>Sunrise Science Products</td>
			<td style="width:119px;">2005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="147">
			<td height="147" style="height:147px;">Yeast extract with 5 supplements (YE5S)</td>
			<td>Sunrise Science Products</td>
			<td style="width:119px;">2011</td>
			<td style="width:167px;">YE5S media with 225 mg/ml of each supplement: adeninie, histidine, leucine, lysine, uracil. The equivalent for budding yeast would be YPD.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">YPD powder</td>
			<td>Sunrise Science Products</td>
			<td style="width:119px;">1875</td>
			<td>For S. cerevisiae&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sorbitol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP439</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Lytic Enzyme</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td style="width:119px;">215352610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lysing Enzymes from Trichoderma harzianum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">L1412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zymolayse-20T</td>
			<td>Sunrise Science Products</td>
			<td style="width:119px;">N0766391</td>
			<td>For S. cerevisiae&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">BODIPY 493/503</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">D-3922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-544-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microscope Cover Glass</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">12-542-B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Plastic transfer pipette</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">137115AM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 liter glass bottle</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">250 ml flask</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2.8 liter flasks</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2. Yeast lipid droplet isolation</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ficoll 400</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane</td>
			<td>SpectrumLabs</td>
			<td style="width:119px;">132680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Tablets</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">11873580001</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dounce Homogenizer&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge Tubes 25x89mm (for SW28)</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;">355642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">12-14k Spectra/Por Dialysis Membrane</td>
			<td>SpectrumLabs</td>
			<td style="width:119px;">132680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Temperature-controlled shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C25KC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">75004521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swinging Bucket Centrifuge Rotor</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">75003607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fiberlite* F15-6x100y Fixed-Angle Rotor</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">75003698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge LB-M</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW28 Ultracentrifuge Rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;">342204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PROTOCOL #2&#160;</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1. Placental villous cells isolation</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable underpads</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">23666062</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Autoclavable pan (container), 3L</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1336110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fine scissors, sharp-sharp, straight</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td style="width:119px;">1406011</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">London Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td style="width:119px;">1108002</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #7b Forceps</td>
			<td>Fine science tools</td>
			<td style="width:119px;">1127020</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Razor blades</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S65921</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Screen cup for CD-1</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S1145</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">40 mesh screen&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S0770</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fisherbrand cell stainers 100&#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22363549</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">150 mm Petri Dishes</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC9054771</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S642</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P333</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KH2PO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">P386</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S374</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">D16</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP310</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2.5% trypsin 10x</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">15090046</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DNase I grade II, from bovine pancreas</td>
			<td>Roche Applied Science</td>
			<td style="width:119px;">10104159001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium bicarbonate solution</td>
			<td>Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S8761</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">500 ml Erlenmeyer flasks</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">250 ml beakers</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">15 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">10 ml serological pipettes</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">50 ml centrifuge tubes</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">DMEM</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11965084</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2. Lipid droplets isolation from villous placental cells</td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris-HCl</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP153</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Sucrose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Carbonate&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">BP357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td style="width:119px;">11873580001</td>
			<td>irritant</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dounce homogenizer&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D9938</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge tubes 25x89mm (for SW28)</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;">355642</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultra-Clear centrifuge tubes 14x89mm (for SW41)</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;">344059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Disposable borosilicate glass pasteur pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">1367820C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Name of Equipment</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Biological safety hood&#160;</td>
			<td style="width:163px;">Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Waterbath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Temperature-controlled shaker</td>
			<td>New Brunswick Scientific</td>
			<td style="width:119px;">C25KC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Thermo Sorvall Legend XTR centrifuge</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">75004521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Swinging Bucket Centrifuge Rotor</td>
			<td>Thermo-Scientific</td>
			<td style="width:119px;">75003607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ultracentrifuge LB-M</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW28 Ultracentrifuge Rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;">342204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SW41 Ti Ultracentrifuge Rotor</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td style="width:119px;">331336</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;"></td>
			<td></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Western blot</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">IRDye 680 Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td style="width:163px;">LI-COR</td>
			<td style="width:119px;">926-68071</td>
			<td>dilution 1:15000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">IRDye&#160; 800CW Goat Anti-Mouse IgG</td>
			<td style="width:163px;">LI-COR</td>
			<td style="width:119px;">926-32210</td>
			<td>dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">NuPAGE&#174; Novex&#174; 12% Bis-Tris gels</td>
			<td style="width:163px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">NP0341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">primary antibodies for PROTOCOL #1</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:353px;">Erg6p</td>
			<td style="width:163px;">gift from Dr. G. Daum</td>
			<td style="width:119px;">Graz University of Technology, Austria</td>
			<td>dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Dpm1p</td>
			<td style="width:163px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab113686</td>
			<td>4 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:353px;">Por1p</td>
			<td style="width:163px;">gift from Dr. G. Daum</td>
			<td style="width:119px;">Graz University of Technology, Austria</td>
			<td>dilution 1:5000</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:353px;">Pma1p</td>
			<td style="width:163px;">gift from Dr. G. Daum</td>
			<td style="width:119px;">Graz University of Technology, Austria</td>
			<td>dilution 1:10000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Vma1p (anti-ATP6V1A)</td>
			<td style="width:163px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab113745</td>
			<td>0.5 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;"></td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">primary antibodies for PROTOCOL #2</td>
			<td style="width:163px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">perilipin 2 (anti-ADFP)</td>
			<td style="width:163px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab52355</td>
			<td>2 &#956;g/ml</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:353px;">calnexin</td>
			<td style="width:163px;">Cell Signaling technology</td>
			<td style="width:119px;">2679</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">GM130</td>
			<td style="width:163px;">Biorbyt</td>
			<td style="width:119px;">orb40533</td>
			<td>dilution 1:25</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:353px;">COX IV</td>
			<td style="width:163px;">Cell Signaling technology</td>
			<td style="width:119px;">4850</td>
			<td>dilution 1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">MEK1</td>
			<td style="width:163px;">Biorbyt</td>
			<td style="width:119px;">orb38775</td>
			<td>dilution 1:50</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of cellular lipid droplets: two purification techniques starting from yeast cells and human placentas

지질 방울은 대부분의 진핵 및 원핵 특정 세포에서 발견 될 수있는 동적 소기관이다. 구조적으로, 방울 인지질 단층으로 둘러싸인 중성 지질의 핵심으로 구성되어 있습니다. 액적 셀룰러 역할을 결정하는데 가장 유용한 기술 중 하나는 작은 방울과 함께 단리 할 수​​있다 결합 단백질의 프로테옴 식별되었다. 분열 효모 및 인간의 태반 융모 세포 : 여기, 두 가지 방법은 두 개의 광범위한 진핵 생물에서 지질 방울과 그들의 결합 된 단백질을 분리 할 수​​ 있도록 서술되어있다. 두 기술의 차이가 있지만, 주요 방법 - 밀도 구배 원심 분리 - 모두 준비가 공유됩니다. 이 제시 액적 분리 기법의 넓은 적용 가능성을 보여준다. 첫 번째 프로토콜에서 효모 세포는 세포벽의 소화 효소에 의해 spheroplasts로 변환됩니다. 그 결과 spheroplasts는 신사된다LY는 헐렁한 균질화에 용해. 피콜은 밀도 구배를 제공하기 위해 파쇄물을 첨가하고, 혼합물을 세 번 원심 분리된다. 첫번째 스핀 후, 지질 방울을 소포체 (ER), 세포막과 액포 함께 원심 분리기 튜브의 하얀색 부동 층에 지역화된다. 두 개의 연속 스핀은 다른 세 가지 세포 기관을 제거하는 데 사용됩니다. 결과는 작은 방울과 결합 단백질을 가지고 층이다. 두 번째 프로토콜에서, 태반 융모 세포는 트립신과 DNA 분해 효소 나 세포가 느슨한 맞는 균질의 균질화되어있는 소화 효소에 의해 인간의 장기 태반에서 격리됩니다. 저속 및 중속 원심 분리 단계는 손상되지 않은 세포, 세포 파편, 핵, 미토콘드리아를 제거하는 데 사용됩니다. 자당은 밀도 구배를 제공하기 위해 파쇄 액에 첨가하고, 혼합물을 다른 cellula로부터 지질 방울을 분리하기 위해 원심 분리R 분수. 두 프로토콜의 지질 방울의 순도는 웨스턴 블롯 분석에 의해 확인된다. 모두 최상의 상태로 준비에서 물방울 분수 이후 프로테오믹스 및 lipidomic 분석에 적합하다.

예상대로 밀도 구배 원심 분리에 근무하는 경우, 부동 층은 지질 방울을 포함해야하고, 고속 스핀의 진행 내내 다른 소기관 고갈 될. 프로토콜 1의 경우, 웨스턴 블롯 마커 지질 방울 (Erg6p)에 대한 항체, 효모, ER (Dpm1p), 미토콘드리아 (Por1p)의 지질 방울과 상호 작용하는 것으로 밝혀졌다 세포 기관으로 수행하고, 세포막 (Pma1p), 및 액포 (Vma1p). 각 3 스핀의 ?...

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Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

1)에서 세포 지질 방울을 분리 효모 세포, 2) 인간의 태반이 제시하는 두 가지 기술. 두 절차의 핵심은 방울을 함유하는 생성 된 부동 층은 쉽게 눈에 의해 시각을 추출하고, 순도에 대한 웨스턴 블롯 분석에 의해 정량화 될 수있는 밀도 구배 원심 분리된다.

세포 지질 방울의 분리 : 효모 세포와 인간의 태반에서 시작 두 정화 기술

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

isolation-cellular-lipid-droplets-two-purification-techniques

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.5K 조회수.  University of Tennessee.  1)에서 세포 지질 방울을 분리 효모 세포, 2) 인간의 태반이 제시하는 두 가지 기술. 두 절차의 핵심은 방울을 함유하는 생성 된 부동 층은 쉽게 눈에 의해 시각을 추출하고, 순도에 대한 웨스턴 블롯 분석에 의해 정량화 될 수있는 밀도 구배 원심 분리된다. 

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Rotating Cell Culture Systems for Human Cell Culture: Human Trophoblast Cells as a Model

The field of human trophoblast research aids in understanding the complex environment established during placentation. Due to the nature of these studies, human in vivo experimentation is impossible. A combination of primary cultures, explant cultures and trophoblast cell lines1 support our understanding of invasion of the uterine wall2 and remodeling of uterine spiral arteries3,4 by extravillous trophoblast cells (EVTs), which is required for successful establishment of pregnancy. Despite the wealth of knowledge gleaned from such models, it is accepted that in vitro cell culture models using EVT-like cell lines display altered cellular properties when compared to their in vivo counterparts5,6. Cells cultured in the rotating cell culture system (RCCS) display morphological, phenotypic, and functional properties of EVT-like cell lines that more closely mimic differentiating in utero EVTs, with increased expression of genes mediating invasion (e.g. matrix metalloproteinases (MMPs)) and trophoblast differentiation7,8,9. The Saint Georges Hospital Placental cell Line-4 (SGHPL-4) (kindly donated by Dr. Guy Whitley and Dr. Judith Cartwright) is an EVT-like cell line that was used for testing in the RCCS.
The design of the RCCS culture vessel is based on the principle that organs and tissues function in a three-dimensional (3-D) environment. Due to the dynamic culture conditions in the vessel, including conditions of physiologically relevant shear, cells grown in three dimensions form aggregates based on natural cellular affinities and differentiate into organotypic tissue-like assemblies10,11,12 . The maintenance of a fluid orbit provides a low-shear, low-turbulence environment similar to conditions found in vivo. Sedimentation of the cultured cells is countered by adjusting the rotation speed of the RCCS to ensure a constant free-fall of cells. Gas exchange occurs through a permeable hydrophobic membrane located on the back of the bioreactor. Like their parental tissue in vivo, RCCS-grown cells are able to respond to chemical and molecular gradients in three dimensions (i.e. at their apical, basal, and lateral surfaces) because they are cultured on the surface of porous microcarrier beads. When grown as two-dimensional monolayers on impermeable surfaces like plastic, cells are deprived of this important communication at their basal surface. Consequently, the spatial constraints imposed by the environment profoundly affect how cells sense and decode signals from the surrounding microenvironment, thus implying an important role for the 3-D milieu13.
We have used the RCCS to engineer biologically meaningful 3-D models of various human epithelial tissues7,14,15,16. Indeed, many previous reports have demonstrated that cells cultured in the RCCS can assume physiologically relevant phenotypes that have not been possible with other models10,17-21. In summary, culture in the RCCS represents an easy, reproducible, high-throughput platform that provides large numbers of differentiated cells that are amenable to a variety of experimental manipulations. 
In the following protocol, using EVTs as an example, we clearly describe the steps required to three-dimensionally culture adherent cells in the RCCS.

Traditional, two dimensional cell culture techniques often result in altered characteristics with respect to differentiation markers, cytokines and growth factors. Three-dimensional cell culture in the rotating cell culture system (RCCS) reestablishes expression of many of these factors as shown here with an extravillous trophoblast cell line.

인간 세포 배양을위한 회전 세포 배양 시스템 : 모델로 인간 Trophoblast 셀

The field of human trophoblast research aids in  understanding the complex environment established during placentation. Due to the  nature of these ...

연구

생체공학

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

타겟 안정 동위 원소 희석 액체 크로마 토그래피 - 질량 분광법 분석을위한 세포 지질 추출

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells (hESCs) and Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to high levels of NK cells after 4 weeks culture and can undergo further 2-log expansion with artificial antigen presenting cells. hESC- and iPSC-derived NK cells developed in this system have a mature phenotype and function. The production of large numbers of genetically modifiable NK cells is applicable for both basic mechanistic as well as anti-tumor studies. Expression of firefly luciferase in hESC-derived NK cells allows a non-invasive approach to follow NK cell engraftment, distribution, and function. We also describe a dual-imaging scheme that allows separate monitoring of two different cell populations to more distinctly characterize their interactions in vivo. This method of derivation, expansion, and dual in vivo imaging provides a reliable approach for producing NK cells and their evaluation which is necessary to improve current NK cell adoptive therapies.

Development, Expansion, and In vivo Monitoring of Human NK Cells from Human Embryonic Stem Cells hESCs and Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs

This protocol describes the development, expansion, and in vivo imaging of NK cells derived from hESCs and iPSCs.

개발, 확대,<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간 배아 줄기 세포 (hESCs에)에서 인간 NK 세포의 모니터링 및 및 유도 된 pluripotent 줄기 세포 (유도 만능)

We present a method for deriving natural killer (NK) cells from undifferentiated hESCs and iPSCs using a feeder-free approach. This method gives rise to ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

미세 유체 제트를 사용하여 지질 이중층 소포 세대

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion receptors and associated signal transduction membrane proteins, the cytoskeletal architecture, and molecular motors1, 2. Mechanosensitivity of different cancer cells in vitro are investigated primarily with immortalized cell lines or murine derived primary cells, not with primary human cancer cells. Hence, little is known about the mechanosensitivity of primary human colon cancer cells in vitro. Here, an optimized protocol is developed that describes the isolation of primary human colon cells from healthy and cancerous surgical human tissue samples. Isolated colon cells are then successfully cultured on soft (2 kPa stiffness) and stiff (10 kPa stiffness) polyacrylamide hydrogels and rigid polystyrene (~3.6 GPa stiffness) substrates functionalized by an extracellular matrix (fibronectin in this case). Fluorescent microbeads are embedded in soft gels near the cell culture surface, and traction assay is performed to assess cellular contractile stresses using free open access software. In addition, immunofluorescence microscopy on different stiffness substrates provides useful information about primary cell morphology, cytoskeleton organization and vinculin containing focal adhesions as a function of substrate rigidity.

A protocol is described to extract primary human cells from surgical colon tumor and normal tissues. The isolated cells are then cultured on soft elastic substrates (polyacrylamide hydrogels) functionalized by an extracellular matrix protein, and embedded with fluorescent microbeads. Traction cytometry is performed to assess cellular contractile stresses.

수술 조직에서 기본 인간 대장 종양 세포의 분리 및 견인 세포 계측법 부드러운 탄성 기판에 직접 배양

Cancer cells respond to matrix mechanical stiffness in a complex manner using a coordinated, hierarchical mechano-chemical system composed of adhesion ...

Techniques for the Evolution of Robust Pentose-fermenting Yeast for Bioconversion of Lignocellulose to Ethanol

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme saccharification processes release sugars that can be fermented by yeast. Traditional industrial yeasts do not ferment xylose (comprising up to 40% of plant sugars) and are not able to function in concentrated hydrolyzates. Concentrated hydrolyzates are needed to support economical ethanol recovery, but they are laden with toxic byproducts generated during pretreatment. While detoxification methods can render hydrolyzates fermentable, they are costly and generate waste disposal liabilities. Here, adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of the native Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to efficiently convert hydrolyzates to economically recoverable ethanol despite adverse culture conditions. Improved individuals are enriched in an evolving population using multiple selection pressures reliant on natural genetic diversity of the S. stipitis population and mutations induced by exposures to two diverse hydrolyzates, ethanol or UV radiation. Final evolution cultures are dilution plated to harvest predominant isolates, while intermediate populations, frozen in glycerol at various stages of evolution, are enriched on selective media using appropriate stress gradients to recover most promising isolates through dilution plating. Isolates are screened on various hydrolyzate types and ranked using a novel procedure involving dimensionless relative performance index (RPI) transformations of the xylose uptake rate and ethanol yield data. Using the RPI statistical parameter, an overall relative performance average is calculated to rank isolates based on multiple factors, including culture conditions (varying in nutrients and inhibitors) and kinetic characteristics. Through application of these techniques, derivatives of the parent strain had the following improved features in enzyme saccharified hydrolyzates at pH 5-6: reduced initial lag phase preceding growth, reduced diauxic lag during glucose-xylose transition, significantly enhanced fermentation rates, improved ethanol tolerance and accumulation to 40 g/L.

Adaptive evolution and isolation techniques are described and demonstrated to yield derivatives of Scheffersomyces stipitis strain NRRL Y-7124 that are able to rapidly consume hexose and pentose mixed sugars in enzyme saccharified undetoxified hydrolyzates and to accumulate over 40 g/L ethanol.

에탄올에 리그 노 셀룰로즈의 생물에 대한 강력한 펜 토스 발효 효모의 진화를위한 기술

Lignocellulosic biomass is an abundant, renewable feedstock useful for production of fuel-grade ethanol and other bio-products. Pretreatment and enzyme ...

Isolation of Mesenchymal Stem Cells from Human Alveolar Periosteum and Effects of Vitamin D on Osteogenic Activity of Periosteum-derived Cells

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the dental sources of MSCs, the periosteum is an easily accessible tissue, which has been identified to contain MSCs in the cambium layer. However, this source has not yet been widely studied.
Vitamin D3 and 1,25-(OH)2D3 have been demonstrated to stimulate in vitro differentiation of MSCs into osteoblasts. In addition, vitamin C facilitates collagen formation and bone cell growth. However, no study has yet investigated the effects of Vitamin D3 and Vitamin C on MSCs.
Here, we present a method of isolating MSCs from human alveolar periosteum and examine the hypothesis that 1,25-(OH)2D3 may exert an osteoinductive effect on these cells. We also investigate the presence of MSCs in the human alveolar periosteum and assess stem cell adhesion and proliferation. To assess the ability of vitamin C (as a control) and various concentrations of 1,25-(OH)2D3 (10&#8722;10, 10&#8722;9, 10&#8722;8, and 10&#8722;7 M) to alter key mRNA biomarkers in isolated MSCs mRNA expression of alkaline phosphatase (ALP), bone sialoprotein (BSP), core binding factor alpha-1 (CBFA1), collagen-1, and osteocalcin (OCN) are measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR).

We present a protocol to investigate the mRNA expression biomarkers of periosteum-derived cells (PDCs) induced by vitamin C (vitamin C) and 1,25-dihydroxy vitamin D [1,25-(OH)2D3]. In addition, we evaluate the ability of PDCs to differentiate into osteocytes, chondrocytes, and adipocytes.

인간의 치경과 파생 셀 Osteogenic 활동에 비타민 D의 효과에서 중간 엽 줄기 세포의 분리

Mesenchymal stem cells (MSCs) are present in a variety of tissues and can be differentiated into numerous cell types, including osteoblasts. Among the ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

Falcarindiol 인간 중간 엽 줄기 세포에 의해 포함 된 새로운 지질 코팅 나노 입자의

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Isolation of Adult Human Dermal Fibroblasts from Abdominal Skin and Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using a Non-Integrating Method

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable diseases, for the reconstitution and regeneration of injured tissues and for the development of new drugs. Despite all the advantages related to the use of iPSCs, such as the low risk of rejection, the lessened ethical issues, and the possibility to obtain them from both young and old patients without any difference in their reprogramming potential, problems to overcome are still numerous. In fact, cell reprogramming conducted with viral and integrating viruses can cause infections and the introduction of required genes can induce a genomic instability of the recipient cell, impairing their use in clinic. In particular, there are many concerns about the use of c-Myc gene, well-known from several studies for its mutation-inducing activity. Fibroblasts have emerged as the suitable cell population for cellular reprogramming as they are easy to isolate and culture and are harvested by a minimally invasive skin punch biopsy. The protocol described here provides a detailed step-by-step description of the whole procedure, from sample processing to obtain cell cultures, choice of reagents and supplies, cleaning and preparation, to cell reprogramming by the means of a commercial non-modified RNAs (NM-RNAs)-based reprogramming kit. The chosen reprogramming kit allows an effective reprogramming of human dermal fibroblast to iPSCs and small colonies can be seen as early as 24 h after the first transfection, even with modifications with the respect to the standard datasheet. The reprogramming procedure used in this protocol offers the advantage of a safe reprogramming, without the risk of infections caused by viral vector-based methods, reduces the cellular defense mechanisms, and allows the generation of xeno-free iPSCs, all critical features that are mandatory for further clinical applications.

Cell reprogramming requires the introduction of key genes, which regulate and maintain the pluripotent cell state. The protocol described enables the formation of induced pluripotent stem cells (iPSCs) colonies from human dermal fibroblasts without viral/integrating methods but using non-modified RNAs (NM-RNAs) combined with immune evasion factors reducing cellular defense mechanisms.

비통합 방법을 사용하여 복부 피부에서 성인 인간 진피 섬유 아세포의 분리 및 유도 만능 줄기 세포의 생성

Induced pluripotent stem cells (iPSCs) could be considered, to date, a promising source of pluripotent cells for the management of currently untreatable ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 심근 세포에서 단세포 광학 작용 잠재적 측정

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...