저자는이 프로젝트에 대한 재정 지원을 제공하기 위해 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회에게 감사의 말씀을 전합니다.

1. 건조 해조류 바이오 매스의 분리 형광 판독을위한 기준으로 사용되는 <ol><li> 건조 바이오 매스의 적어도 200 밀리그램을 제공 할 것입니다 성장하는 조류 배양에서 샘플 볼륨을 제거, 400 ~ 600 밀리그램이 바람직하다. </li><li> 10,000 × g에서 10 분 동안 4 ° C에서 샘플을 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 성장 미디어와 같은 pH로 공식화 인산염 완충액 같은 부피와 펠렛을 씻으십시오. </li><li> 3 세척 단계의 총 단계 1.2를 반복한다. </li><li> 탈 이온수의 펠렛을 다시하면 일시 중지하고 무게를 미리 무게를 접시에 전송할 수 있습니다. 48 시간 동안 50 ℃에서 건조시켜주십시오. 참고 : 진공 상태에서 건조하면 건조 시간을 단축하고 50 ° C 이상의 온도에서 문화를 건조하는 것은 재 부상을 어렵게 만들 수 있습니다. </li><li> 나중에 사용하기 위해 상온에서 저장, 건조 해조류 문화. </li></ol> 헥산 추출 중성 지질의 2. 중량 측정 정량화 (Bligh 고와 다이어 4에서 적응) <ol><li> 무게 접시에 건조 해조류 바이오 매스의 약 50 밀리그램을 측정합니다. 주 : 40 ~ 80 밀리그램에 이르기까지 대중 재현성의 손실없이 사용할 수 있습니다. </li><li> 박격포 헥산으로 미리 세척에 바이오 매스를 전송합니다. 필요한 경우, 완전 모르타르에 바이오 매스를 옮기기 위하여 파스퇴르 피펫을 사용하여 소량의 헥산 (1 ㎖)로 계량 접시 세척. 참고 : 헥산이 높은 휘발성과 독성 물질이다. 그것은 적절한 보호 복 흄 후드에서 처리해야합니다. </li><li> 유봉을 이용하여 5 분 동안 조류 바이오 매스를 분쇄. 부드러운 연마로 시작하고 점차 강도를 증가시킨다. 5 분 동안의 미세하고 부드러운 붙여 넣기로 바이오 매스를 갈기. 모르타르에 바이오 매스를 전송할 때 과량의 헥산을 사용하는 경우, 헥산 연삭 전에 증발 기다리는 것이 최상이다. </li><li> 박격포에 헥산 수 ml를 추가하고이 균질화 될 때까지 유 봉 생성 된 슬러리를 혼합한다. 모든 세포 파편이 MOR의 벽에 부착되었는지 확인타르는 무료 두드려 액체에 일시 중단됩니다. </li><li> 원심 관에 헥산 - 세포괴 혼합물을 전송. 참고 : 원심 분리 관은 유리 또는 테플론 헥산과 호환되는 적절한 고분자이어야합니다. </li><li> 모든 바이오 매스는 원심 분리 관 (3 배)로 전송 될 때까지 반복하여 2.4 및 2.5 단계를 반복합니다. </li><li> 원심 분리기 10,000 × g에서 20 분 동안 4 ° C에서 샘플. </li><li> 조심스럽게 미리 무게 금속 접시의 무게에 뜨는을 피펫. 흄 후드에 저장합니다. </li><li> 펠렛에 헥산 3 ㎖를 추가하고 1 분 동안 격렬하게 소용돌이로 교반하여 2 차 헥산 추출을 수행합니다. </li><li> 반복은 2.7 및 2.8 단계를 반복합니다. 필요한 경우, 모든 세포 파편이 완전히 정착하기 위해 두 번째 추출 동안 원심 분리기에서 30 분 동안 샘플을 실행합니다. 헥산이 증발 한 후 중량 측정 추출 오일의 질량을 결정합니다. </li></ol> 나일 레드를 사용하여 중성 지질 3. 형광 측정 정량화 (REPOR로테드 드 라 Hoz라고 Siegler 등. 11에 의해) 참고 : 5g / L에서 조류 현탁액의 10 μL가 형광 판독 필요합니다. 일반적으로, 배양액의 1.5 ML에서 건조 해조류 바이오 매스의 분리가 충분 이상입니다. 또, 분광 광도계에서 램프의 빛의 세기는 시간이 지남에 따라 저하 될 수있다. 그것은 악기의 변화는 측정에 불필요한 오류를 추가하지 않도록 모든 실험에서 기준을 포함​​하는 것이 좋습니다. <ol><li> 알코올 시약 급 에탄올 10 μg / ml의 농도로 나일 레드 용액을 준비한다. 4 ° C에서 어둠 속에서이 솔루션을 저장 </li><li> 4 ℃에서 탈 이온수 및 저장에 30 % (v / v) 에탄올 용액을 제조 </li><li> 같은 바이오 매스 농도 (/ L 5g 권장)에서와 측정에 사용되는 기준과 동일한 방식으로 모든 조류의 샘플을 준비합니다. 적절한 양의 하나를 중단 미리​​ 건조 샘플하여이 작업을 수행인산염 완충액 (0.6 g / L 칼륨, 제 2 인산, 1.4 g / L의 칼륨 인산) 또는 탁도를 측정 한 후, 인산 완충액으로 5g / L로 증가 조류 배양의 농도를 조정. 참고 : 라이브 조류 배양에서 수행되는 측정은 종종 탁도 보정 곡선의 정밀도에 따라 그와 관련된 더 큰 과실이있을 것이다. 건조 된 샘플을 완전히 재현 탁하여 바이오 매스를 분산시키는 호모 게 나이저를 사용하는 방법을 필요로 할 수있다. </li><li> 각 샘플의 경우, 96 - 웰 플레이트의 하나의 잘에 30 % 에탄올 용액 80 μL, 나일 레드 용액 10 μL, 그리고 조류 현탁액의 10 μl를 섞는다. 적절 형광 측정의 변동을 고려하기 위해서, 각 샘플을 5 회 반복 수행한다. </li><li> 악기와 준비 일상적인 변동을 고려하기 위해 미리 제조 기준을 두 포인트 보정 곡선을 실행합니다. 발을 이용한 형광 측정 용 표준 준비샘플로 AME 절차. 참고 : 일반적으로 두 점은 악기의 재 교정을 위해, 3 점 선형성을 확인하기 위해 실행할 수있는 충분합니다. </li><li> 멀티 웰 플레이트 리더 분광 광도계의 형광 측정을 수행합니다. 다음 조건은 가장 일관된 결과 (11)를 수득 발견 하였다 : <ol><li> 30 초 동안 1,200 rpm으로, 궤도 3mm에서 흔들어. </li><li> 10 분 동안 40 ° C에서 알을 품다. </li><li> 30 초 동안 1,200 rpm으로, 궤도 3mm에서 흔들어. </li><li> 기록 형광, 530 nm에서 여기, 604 nm에서 방출. </li></ol></li><li> 내부 표준의 결과를 이용하여 유분을 형광 측정을 변환. </li></ol> 4. 형광 현미경 기술 NOTE : 섹션 3에 기재된 염색 프로토콜은 정량 분석​​을 위해 설계되지만, 또한 교육 및 예시를 위해 PU 스며 기반 기술의 시각적 표현을 제공하는 것이 유용 할 수있다rposes. 샘플 형광 하나의 이미지를 생성하려면 기존의 전송 및 추가 표면 형광 조명 소스와 광학 현미경이 필요합니다. 530 nm의 (녹색) 및 604 nm의 (적색) 범위의 여기 및 발광 광 필터는 각각 나일 레드 얼룩뿐만 아니라 관련 소프트웨어와 현미경 장착 된 카메라가 필요합니다. 이 연구 결과 (도 1)에 도시하는 이미지는 RGB 변환 부에 카메라와 흑백 구비 명 시야 현미경을 사용하여 획득 하였다. 이러한 도구를 사용하여 나일 레드 형광 이미지를 생성하는 절차는 아래에 설명되어 있습니다 : <ol><li> 프로토콜의 제 3 항에 따라 나일 레드 얼룩과 문화의 샘플을 준비합니다. NOTE : 5g / L의 농도 범위에있는 샘플에서는 혼잡없이 적절한 세포 밀도의 슬라이드를 생성한다. </li><li> 염색 프로토콜의 단계 3.6를 완료 한 후, 표준 실험실 절차에 따라 처리 된 시료의 현미경 슬라이드를 준비합니다. </li><li> 전송 모드에서 현미경을 시작으로, 현미경에 준비된 슬라이드를로드하고 원하는 배율 (이 문서에 표시된 이미지가 100X의 목적으로 취득한)에서 세포를 찾습니다. </li><li> 집중되면, 표면 형광 조명 모드로 송신으로부터 현미경을 전환. 광원은 이제 (이것은 슬라이드와 대물 렌즈 사이의 공간을 육안으로 관찰함으로써 확인 될 수있다), 대물 렌즈로부터 직접 올 것이다. </li><li> 관찰의 빛 경로에 광원과 적색 발광 필터에 녹색 여기 필터를 삽입; 염색 된 세포의 형광 지금 접안 렌즈를 통해 직접 볼 수 있어야합니다. </li><li> 마운트 카메라에 접안에서 현미경 관찰 모드를 전환 한 세포의 형광 이미지를 캡처 시청 소프트웨어를 이용한다. 카메라의 감도에 따라 샘플은 처음에 (미리보기 창에 표시되지 않을 수도 화면, 즉 것) 검은 색으로; 이 문제를 해결하기 위해, 세포를 볼 수 있습니다 수준으로 노출 시간과 카메라의 게인을 조정합니다. 특정 설정은 악기, 장비, 세포 유형에 따라 다르다. </li></ol>

<ol>
	<li>Chisti, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodiesel+from+microalgae.">Biodiesel from microalgae.</a> Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=National+Algal+Biofuels+Technology+Roadmap.+Energy+Efficiency+&amp;+Renewable+Energy.">National Algal Biofuels Technology Roadmap. 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Meth. 55, 411-418 (2003).</li><li>Chen, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+Nile+red+method+for+quantitative+measurement+of+neutral+lipids+in+microalgae.">A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae.</a> J. Microbiol. Meth. 77, 41-47 (2009).</li><li>de la Hoz Siegler, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+the+reliability+of+fluorescence-based+neutral+lipid+content+measurements+in+microalgal+cultures.">Improving the reliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements in microalgal cultures.</a> Algal Res. 1, 176-184 (2012).</li><li>de la Jara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+determination+of+lipid+content+in+a+marine+dinoflagellate,+Crypthecodinium+cohnii.">Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii.</a> J. Appl. Phycol. 15, 433-438 (2003).</li><li>Elsey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+measurement+of+microalgal+neutral+lipids.">Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids.</a> J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).</li><li>Feng, G. -. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+FT-IR+and+Nile+Red+methods+for+microalgal+lipid+characterization+and+biomass+composition+determination.">Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination.</a> Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).</li><li>Guzm&#225;n, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimate+by+means+of+flow+cytometry+of+variation+in+composition+of+fatty+acids+from+Tetraselmis+suecica+in+response+to+culture+conditions.">Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture conditions.</a> Aquacult. Int. 18, 189-199 (2010).</li><li>Huang, G. -. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+screening+method+for+lipid+production+in+alga+based+on+Nile+red+fluorescence.">Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence.</a> Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).</li><li>Lee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+method+for+the+determination+of+lipid+from+the+green+alga+Botryococcus+braunii.">Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii.</a> Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).</li><li>Montero, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+high-lipid+content+strains+of+the+marine+microalga+Tetraselmis+suecica+for+biodiesel+production+by+flow+cytometry+and+single-cell+sorting.">Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting.</a> J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).</li><li>Vigeolas, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+partial+characterization+of+mutants+with+elevated+lipid+content+in+Chlorella+sorokiniana+and+Scenedesmus+obliquus.">Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus.</a> J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).</li><li>Bertozzini, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+the+standard+addition+method+for+the+absolute+quantification+of+neutral+lipids+in+microalgae+using+Nile+red.">Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red.</a> J. Microbiol. Meth. 87, 17-23 (2011).</li><li>Kou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+measurement+of+lipid+content+in+the+model+organism+Chlamydomonas+reinhardtii.">Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii.</a> J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).</li></ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

표준 곡선에 사용 된 조류는 그 측정되는 것과 같은 실험 조건에서 재배 같은 종해야합니다. 미디어 구성, 재배 기술 및 염색 프로토콜의 중요한 변화는 형광 독서의 강도에 영향을 줄 수 있습니다. (섹션 1 및 2에 기재되어 있음)의 헥산 추출에 사용되는 표준 곡선 샘플의 중성 지질 함량을 결정하는 데 사용되었다. 정확한 형광 강도 측정의 경우, 모든 샘플은 같은 미생물 농도 (5g / L이 연구에 사?...

인해 특정 스트레스 조건하에 지질 체를 저장할 수있는 능력으로, 조류 전위 재생 연료 원 1,2로서 최근 주목을 받아왔다. 중성 지질은 적절한 성장 조건 3에서 세포 건조 중량의 60 %를 차지하고 있습니다. 그러나 업계는 제대로, 생물 공정의 성능을 모니터링 문화를 분석하고, 새로운 변종에 대한 화면을 위해 조류 세포의 지질 함량을 정량하는, 간단한 청소, 신속하고 신뢰할 수있는 표준화 된 프로토콜을 가지고 있지 않습니다. Bligh 고 - 다이어 중량 측정 방법은 약 50 년 전에 개발 된 오늘날 4,5 가장 일반적으로 사용되는 기술 중 하나 남아있다. 이 절차는, 간단하고 안정적​​이며 수행하기 쉬운 반면, 시간 소모적 인 큰 양의 샘플을 필요로하고, 독성 용매를 사용한다. 그것은 발효 실행에서 많은 샘플을 분석하거나 새로운 석유가 풍부한 균주 선별을위한 실용적되지 않습니다. 다른 방법은 ㄱ있다EEN 개발 만, 통상 첨단 장비가 필요하고 6 표준화되지 않았다. 관심의 큰 거래를 얻고있다 대체 나일 레드 얼룩입니다. 나일 레드, 비극성 환경에서 우선적으로 형광 염료, 선충 7, 효모 8, 9 박테리아, 조류 10-19 등 다양한 생물 지질 시체의 신원을 확인하거나 정량하는 데 사용되었습니다. 나일 레드를 포함하는 초기 기술은 단일 베트 광도법 또는 유동 세포 계측법 얼룩을 결합, 주로 정성 또는 반 정량적이었다. 또, 녹조류와 같은 조류의 일부 클래스는 기술 (10)의 범위를 한정 염료에 주로 불 투과성이다 두꺼운 셀 웰있다. 나일 레드 염색법에 최근 개선은 프로토콜 10, 11의 초기 단점을 무시하는보고되었습니다. 카의 존재하에 세포를 염색IER은 DMSO (10)로서 용매 또는 에탄올 10,11 안심 정량적 측정을 허용 유분와 흡광도 사이의 관계를 선형화한다. 용매 나일 레드 분자가 통과 할 수 있도록 세포막을 투과 돕는다. 또한, 마이크로 플레이트 판독 기능을 분광 광도계를 통합하는 것은 정량 분석​​에 적합한 높은 처리량 프로토콜을 가능하게한다. 이 문서에서 우리는 세부 사항에있는 에탄올, 중성 용매의 존재 나일 레드와 문화를 염색하여 조류 세포의 오일 함량을 측정하는 간단한 방법. 가장 정확하게하기 위해 측정에서 배경 노이즈를 차지하고, 유분으로 형광 강도를 상관 표준 곡선은 공지 된 오일 조성물의 조류 세포를 사용하여 개발된다. 이 방법은 이전에 발행 된 프로토콜 10, 11에서 적응됩니다. 96 - 웰 분광 광도계를 사용하여, 하나는 시간 그쪽에서 샘플의 동일한 양을 분석 할 수있다t는 중량 측정 방법으로 모니터링 할 수 일이 걸릴 것입니다. 또한, 원하는 조류 종의 대표 샘플을 사용하여 교정하여이 방법은 직접 해석 비교적 정확한 측정을 생산하고 있습니다. 다른 긴장과 애플리케이션에 최적화 나일 레드와 조류를 염색하는 방법을 요약 많은 프로토콜이 존재한다; 그것은 더 많은 종과 클래스에 대한 가능성이 적합하지만 여기에 제시된 프로토콜은 원래, Auxenochlorella의 protothecoides에 드 라 Hoz라고 Siegler 등. (11)에 의해 클로렐라 심상 성, Scenedesmus의 dimorphus 및 Scenedesmus의 obliquus을 개발했다. 이 모니터링 생물 공정 성능의 특정 응용 프로그램으로 설계되고있어 성장 문화에서 이전에 건조 된 샘플 및 젖은 샘플 동일하게 작동합니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="817">
	<colgroup>
		<col />
		<col span="2" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Dry Weight</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">25 ml disposable pipettes</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">13-676-10K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Pipette Bulb</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">13-681-51</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">05-562-16A</td>
			<td>Teflon needed for hexane</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Weigh Dishes (polypropylene)</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">2-202B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">1.5 ml micro-centrifuge tubes</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">05-408-129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:152px;">Sorvall</td>
			<td style="width:152px;">RC6plus</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Drying Oven (Fisher 625D)</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">13-254-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Storage vials</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">0337-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D)</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">05-40-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Gravimetric Quantification</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Porcelain Mortar (Coorstek)</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">12-961A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Porcelain Pestle (Coorstek)</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">12-961-5A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">40 ml Centrifugation tubes (FEP)</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">05-562-16A</td>
			<td>Could also use glass tubes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Pasteur Glass Pipettes</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">13-678-20C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Aluminum weigh dishes</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">08-732-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Hexanes</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">H292-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="18">
			<td height="18" style="height:18px;width:347px;">Fluorometric quantification of oil content</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:347px;">Fluorescence multi-well plate reader</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Lab Systems</td>
			<td style="width:152px;">Fluoroskan Ascent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Fluorescence reader software</td>
			<td style="width:152px;">Thermo Lab Systems</td>
			<td style="width:152px;">Ascent Software 2.6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">COSTAR 96 well plate with round bottom</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">06-443-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Nile Red&#160;</td>
			<td style="width:152px;">Sigma</td>
			<td style="width:152px;">N3013-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Ethanol (Alcohol reagent grade)</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">AC65109-0020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Imaging Fluorescent cells</td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td style="width:152px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope</td>
			<td style="width:152px;">Leica</td>
			<td style="width:152px;">DMRXA2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Microscope cover slips</td>
			<td style="width:152px;">Fisher</td>
			<td style="width:152px;">12-541B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Camera</td>
			<td style="width:152px;">Qimaging</td>
			<td style="width:152px;">Retiga Ex</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Imaging software</td>
			<td style="width:152px;">Qimaging</td>
			<td style="width:152px;">QCapture v.1.1.8</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple and rapid protocol for measuring neutral lipids in algal cells using fluorescence

조류는 자연 지질 저장 기능으로 인해 신 재생 연료 원에 대한 우수한 후보로 간주됩니다. 조류 발효 공정과 새로운 석유가 풍부한 균주에 대한 심사의 강력한 모니터링은 세포 내 지질 함량의 측정을위한 빠르고 신뢰할 수있는 프로토콜을 필요로한다. 현재 관행이 기름 내용을 결정하기 위해 크게 중량 측정 방법에 의존, 기술은 시간이 소요되며 많은 양의 샘플을 필요로 수십 년 전에 개발. 본 논문에서는, 나일 레드, 생물의 다양한 종류의 지질 기관의 존재를 식별하는 데 사용 된 형광 염료는 Auxenochlorella의 protothecoides의 중성 지질 함량, 녹색을 측정하기위한, 간단하고, 빠르고, 믿을 수있는 프로토콜에 통합 조류. 방법은 염색 전에 세포막 및 형광 세기 측정 중에 샘플 용량을 증가 96 웰 마이크로 플레이트를 투과하는, 에탄올, 비교적 온화한 용매를 사용한다. 그것은 설계되었습니다모니터링 생물 공정 성능의 특정 응용 프로그램과 ED. 성장 배양 물로부터 샘플을 건조 또는 살아있는 샘플 분석에 사용될 수있다.

나일 붉은 염료로 염색 대표 조류 세포를 그림 1에 나타내었다. 파트 A와 파트 A의 그림 1 디스플레이 이미지의 B protothecoides 매우 낮은 세포 내 지질 축적에 이르는, 과잉 질소에서 성장. A. 일부 C와 D, 샘플 질소를 제한 한 성장에 따라 protothecoides이 표시됩니다. 투과 조명 하에서, 세포의 지질 체들은 반짝이 ...

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A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

나일 레드 염색 절차를 사용하여 조류 세포의 중성 지질 함량을 결정하기위한 간단한 프로토콜을 설명한다. 이 시간을 절약 할 수있는 기술은 기존의 중량 측정 기반 지질 정량 프로토콜에 대한 대안을 제공합니다. 그것은 모니터링 생물 공정 성능의 특정 애플리케이션을 위해 설계되었다.

형광을 사용하여 조류 세포에서 중성 지질을 측정하기위한 간단하고 빠른 프로토콜

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

a-simple-rapid-protocol-for-measuring-neutral-lipids-algal-cells

Research

JoVE Journal

Chemistry

35.3K 조회수.  University of Alberta.  나일 레드 염색 절차를 사용하여 조류 세포의 중성 지질 함량을 결정하기위한 간단한 프로토콜을 설명한다. 이 시간을 절약 할 수있는 기술은 기존의 중량 측정 기반 지질 정량 프로토콜에 대한 대안을 제공합니다. 그것은 모니터링 생물 공정 성능의 특정 애플리케이션을 위해 설계되었다. 

비디오: A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry (UPLC-HRMS)

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first separated into polar and non-polar fractions by a liquid-liquid phase extraction, and partially purified to facilitate downstream analysis. Both aqueous (polar metabolites) and organic (non-polar metabolites) phases of the initial extraction are processed to survey a broad range of metabolites. Metabolites are separated by different liquid chromatography methods based upon their partition properties. In this method, we present microflow ultra-performance (UP)LC methods, but the protocol is scalable to higher flows and lower pressures. Introduction into the mass spectrometer can be through either general or compound optimized source conditions. Detection of a broad range of ions is carried out in full scan mode in both positive and negative mode over a broad m/z range using high resolution on a recently calibrated instrument. Label-free differential analysis is carried out on bioinformatics platforms. Applications of this approach include metabolic pathway screening, biomarker discovery, and drug development.

Untargeted Metabolomics from Biological Sources Using Ultraperformance Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry UPLC-HRMS

Untargeted metabolomics provides a hypothesis generating snapshot of a metabolic profile. This protocol will demonstrate the extraction and analysis of metabolites from cells, serum, or tissue. A range of metabolites are surveyed using liquid-liquid phase extraction, microflow ultraperformance liquid chromatography/high-resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS) coupled to differential analysis software.

Ultraperformance 액체 크로마토 그래피 고해상도 질량 분석 (UPLC-HRMS)를 사용하여 생물 소스에서 타겟이 불분명 한 대사

Here we present a workflow to analyze the metabolic profiles for biological samples of interest including; cells, serum, or tissue. The sample is first ...

연구

화학

Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

화학 고정하여 X-ray 형광 이미징 부착 세포를 준비

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, and that these chemical fingerprints can be used for plant species identification. The mass spectral data can be acquired rapidly and in a high throughput manner without the need for sample extraction, derivatization or pH adjustment steps. The use of this technique bypasses challenges presented by more conventional techniques including lengthy chromatography analysis times and resource intensive methods. The high throughput capabilities of the direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry protocol, coupled with multivariate statistical analysis processing of the data, provide not only class characterization of plants, but also yield species and varietal information. Here, the technique is demonstrated with two psychoactive plant products, Mitragyna speciosa (Kratom) and Datura (Jimsonweed), which were subjected to direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry followed by statistical analysis processing of the mass spectral data. The application of these tools in tandem enabled the plant materials to be rapidly identified at the level of variety and species.

A method for species identification of botanical material by direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry and multivariate statistical analysis is presented.

실시간 고해상도 질량 분석에 직접 분석을 사용하여 식물 소재의 신속한 높은 처리량 종 확인

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

A Simple and Efficient Protocol for the Catalytic Insertion Polymerization of Functional Norbornenes

Norbornene can be polymerized by a variety of mechanisms, including insertion polymerization whereby the double bond is polymerized and the bicyclic nature of the monomer is conserved. The resulting polymer, polynorbornene, has a very high glass transition temperature, Tg, and interesting optical and electrical properties. However, the polymerization of functional norbornenes by this mechanism is complicated by the fact that the endo substituted norbornene monomer has, in general, a very low reactivity. Furthermore, the separation of the endo substituted monomer from the exo monomer is a tedious task. Here, we present a simple protocol for the polymerization of substituted norbornenes (endo:exo ca. 80:20) bearing either a carboxylic acid or a pendant double bond. The process does not require that both isomers be separated, and proceeds with low catalyst loadings (0.01 to 0.02 mol%). The polymer bearing pendant double bonds can be further transformed in high yield, to afford a polymer bearing pendant epoxy groups. These simple procedures can be applied to prepare polynorbornenes with a variety of functional groups, such as esters, alcohols, imides, double bonds, carboxylic acids, bromo-alkyls, aldehydes and anhydrides.

We describe the catalytic insertion polymerization of 5-norbornene-2-carboxylic acid and 5-vinyl-2-norbornene to form functional polymers with a very high glass transition temperature.

기능 노보 넨의 촉매 삽입 중합을위한 간단하고 효율적인 프로토콜

Norbornene can be polymerized by a variety of mechanisms, including insertion polymerization whereby the double bond is polymerized and the bicyclic ...

A Protocol for Safe Lithiation Reactions Using Organolithium Reagents

Organolithium reagents are powerful tools in the synthetic chemist&#39;s toolbox. However, the extreme pyrophoric nature of the most reactive reagents warrants proper technique, thorough training, and proper personal protective equipment. To aid in the training of researchers using organolithium reagents, a thorough, step-by-step protocol for the safe and effective use of tert-butyllithium on an inert gas line or within a glovebox is described. As a model reaction, preparation of lithium tert-butyl amide by the reaction of tert-butyl amine with one equivalent of tert-butyl lithium is presented.

The safe and proper use of organolithium reagents is described.

유기 리튬 시약을 사용하여 안전 리튬 화의 반응을위한 프로토콜

Organolithium reagents are powerful tools in the synthetic chemist&#39;s toolbox. However, the extreme pyrophoric nature of the most reactive reagents ...

Simultaneous Measurement of HDAC1 and HDAC6 Activity in HeLa Cells Using UHPLC-MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since the approval of romidepsin, a class I HDAC inhibitor for cancer therapy, and the clinical investigation of HDAC6-specific inhibitors for multiple myeloma. The present method is used to determine the inhibitory activity of test compounds on HDAC1 and HDAC6 in cells. The isoform activity is measured using the ultra-high-performance liquid chromatography &#8211; mass spectrometry (UHPLC-MS) analysis of specific substrates incubated with treated and untreated HeLa cells. The method has the advantage of reflecting the endogenous HDAC activity within the cell environment, in contrast to cell-free biochemical assays conducted on isolated isoforms. Moreover, because it is based on the quantification of synthetic substrates, the method does not require the antibody recognition of endogenous acetylated proteins. It is easily adaptable to several cell lines and an automated process. The method has already proved useful in finding HDAC6-selective compounds in neuroblasts. Representative results are shown here with the standard HDAC inhibitors trichostatin A (non-specific), MS275 (HDAC1-specific), and tubastatin A (HDAC6-specific) using HeLa cells.

The present method serves to identify isoform-specific inhibitors of histone deacetylases (HDAC) in HeLa cells by the UHPLC-MS analysis of multiple substrates. This is an antibody-free method developed to reflect HDAC1 and HDAC6 activity in the living cell environment, in contrast to single-isoform cell-free assays.

헬러의 HDAC1 및 HDAC6의 동시 측정 셀 사용 하 여 UHPLC MS

The search for new histone deacetylase (HDAC) inhibitors is of increasing interest in drug discovery. Isoform selectivity has been in the spotlight since ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical composition and elemental distribution within a material. Synchrotron-based XRF has become an integral characterization technique for a variety of research topics, particularly due to its non-destructive nature and its high sensitivity. Today, synchrotrons can acquire fluorescence data at spatial resolutions well below a micron, allowing for the evaluation of compositional variations at the nanoscale. Through proper quantification, it is then possible to obtain an in-depth, high-resolution understanding of elemental segregation, stoichiometric relationships, and clustering behavior.
This article explains how to use the MAPS fitting software developed by Argonne National Laboratory for the quantification of full 2-D XRF maps. We use as an example results from a Cu(In,Ga)Se2 solar cell, taken at the Advanced Photon Source beamline 2-ID-D at Argonne National Laboratory. We show the standard procedure for fitting raw data, demonstrate how to evaluate the quality of a fit and present the typical outputs generated by the program. In addition, we discuss in this manuscript certain software limitations and offer suggestions for how to further correct the data to be numerically accurate and representative of spatially resolved, elemental concentrations.

Here, we demonstrate the use of the X-ray fluorescence fitting software, MAPS, created by Argonne National Laboratory for the quantification of fluorescence microscopy data. The quantified data that results is useful for understanding the elemental distribution and stoichiometric ratios within a sample of interest.

지도 사용 하 여 x 선 형광 데이터 측정

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Fabrication and Testing of Catalytic Aerogels Prepared Via Rapid Supercritical Extraction

Protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms are presented. Three preparation methods are described: (a) the incorporation of metal salts into silica or alumina wet gels using an impregnation method; (b) the incorporation of metal salts into alumina wet gels using a co-precursor method; and (c) the addition of metal nanoparticles directly into a silica aerogel precursor mixture. The methods utilize a hydraulic hot press, which allows for rapid (&#60;6 h) supercritical extraction and results in aerogels of low density (0.10 g/mL) and high surface area (200-800 m2/g). While the work presented here focuses on the use of copper salts and copper nanoparticles, the approach can be implemented using other metal salts and nanoparticles. A protocol for testing the three-way catalytic ability of these aerogels for automotive pollution mitigation is also presented. This technique uses custom-built equipment, the Union Catalytic Testbed (UCAT), in which a simulated exhaust mixture is passed over an aerogel sample at a controlled temperature and flow rate. The system is capable of measuring the ability of the catalytic aerogels, under both oxidizing and reducing conditions, to convert CO, NO and unburned hydrocarbons (HCs) to less harmful species (CO2, H2O and N2). Example catalytic results are presented for the aerogels described.

Here we present protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms. Methods for preparing materials using copper salts and copper-containing nanoparticles are featured. Catalytic testing protocols demonstrate the effectiveness of these aerogels for three-way catalysis applications.

제조 및 급속 한 초 임계 추출 통해 준비 촉매 Aerogels의 테스트

Protocols for preparing and testing catalytic aerogels by incorporating metal species into silica and alumina aerogel platforms are presented. Three ...

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity and convenient colorimetric readout. However, high densities of nanoparticles are typically needed for detection. The available synthesis-based enhancement protocols are either limited to gold and silver nanoparticles or rely on precise enzymatic control and optimization. Here, we present a protocol to enhance the colorimetric readout of gold, silver, silica, and iron oxide nanoprobes. It was observed that the colorimetric signal can be improved by up to a 10000-fold factor. The basis for such signal enhancement strategies is the chemical reduction of Au3+ to Au0. There are several chemical reactions that enable the reduction of Au3+ to Au0. In the protocol, Good&#39;s buffers and H2O2 are used and it is possible to favor the deposition of Au0 onto the surface of existing nanoprobes, in detriment of the formation of new gold nanoparticles. The protocol consists of the incubation of the microarray with a solution consisting of chloroauric acid and H2O2 in 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid pH 6 buffer following the nanoprobe-based detection assay. The enhancement solution can be applied to paper and glass-based sensors. Moreover, it can be used in commercially available immunoassays as demonstrated by the application of the method to a commercial allergen microarray. The signal development requires less than 5 min of incubation with the enhancement solution and the readout can be assessed by naked eye or low-end image acquisition devices such as a table-top scanner or a digital camera.

Rapid Nanoprobe Signal Enhancement by In Situ Gold Nanoparticle Synthesis

In this work, a protocol for signal enhancement of nanoprobe-based biosensing is presented. The protocol is based on the reduction of chloroauric acid onto the surface of existing nanoprobes that consist of gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles.

에 라 골드 나노 입자 합성에 의해 급속 한 Nanoprobe 신호 향상

The use of nanoprobes such as gold, silver, silica or iron-oxide nanoparticles as detection reagents in bioanalytical assays can enable high sensitivity ...

Separation of Aldehydes and Reactive Ketones from Mixtures Using a Bisulfite Extraction Protocol

The purification of organic compounds is an essential component of routine synthetic operations. The ability to remove contaminants into an aqueous layer by generating a charged structure provides an opportunity to use extraction as a simple purification technique. By combining the use of a miscible organic solvent with saturated sodium bisulfite, aldehydes and reactive ketones can be successfully transformed into charged bisulfite adducts that can then be separated from other organic components of a mixture by the introduction of an immiscible organic layer. Here, we describe a simple protocol for the removal of aldehydes, including sterically-hindered neopentyl aldehydes and some ketones, from chemical mixtures. Ketones can be separated if they are sterically unhindered cyclic or methyl ketones. For aliphatic aldehydes and ketones, dimethylformamide is used as the miscible solvent to improve removal rates. The bisulfite addition reaction can be reversed by basification of the aqueous layer, allowing for the re-isolation of the reactive carbonyl component of a mixture.

Here, we present a protocol to remove aldehydes and reactive ketones from mixtures by a liquid-liquid extraction protocol directly with saturated sodium bisulfite in a miscible solvent. This combined protocol is rapid and facile to perform. The aldehyde or ketone can be re-isolated by the basification of the aqueous layer.

알 데히드 류와 Ketones 반응 황산 추출 프로토콜을 사용 하 여 혼합물에서 분리

The purification of organic compounds is an essential component of routine synthetic operations. The ability to remove contaminants into an aqueous layer ...