The authors acknowledge Stefan Vogt for his assistance in the fitting of the representative data shown in this paper, and helpful discussions. The authors also acknowledge Chris Jacobsen for his support to Q. J. 
Use of the Advanced Photon Source, beamlines 2-ID-E and 8-BM-B, at Argonne National Laboratory was supported by the U. S. Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, under Contract No. DE-AC02-06CH11357.

악기, 기판, 문화 미디어와 요리 1. 준비 <ol><li> 실리콘 나이트 (시 3 N 4) 윈도우의 취급. <ol><li> 한편으로 캡슐의 타단을 회전시키면서 약간 창 자체 짜지하는 방식으로 윈도우를 함유 한 단부를 압착하여 캡슐을 연다. </li><li> 역의 쌍을 확인, 실체 현미경 아래 뾰족한 핀셋 끝에 접착제, 틈새 나 굴곡이 없는지 확인합니다. 그렇지 않으면, 창은 핀셋으로 파손 또는 후속 단계에서 그들을 떨어져 비행 할 수있다. </li><li> 부드럽게 윈도우의 가장자리가 나올 필요로하는 곳에 캡슐을 넓게 할 수 있도록하는 방향으로 압력을 개방 끝 부분에 캡슐을 압박하면서, 조심스럽게 핀셋 윈도우의 프레임을 잡고 캡슐에서 창을 제거합니다. </li></ol></li><li> 창 미리 세척 (선택 사항). <ol><li> 부드럽게를 담그고, 미리 세척 창을 원하는 경우70 % 에탄올에서 2 분 세척 100 % 에탄올에서 2 분 세척 한 다음 5 초 동안 증류수에. </li></ol></li><li> 부착 및 배양 접시에 창을 살균. <ol><li> 창문을 부착하기 위해, 배양 접시의 바닥에 평평한면을 위로해서 창을 설정, 깨끗한 유리 슬라이드에 테이프의 조각을 배치합니다. 테이프의 긴 측면 아래 기장 스트립을 약 잘라. 깨끗한 면도날 ( &quot;¾에 의해&quot;⅛에서) 짧은 측 떨어져 테이프의 조각을 가져 가라. </li><li> 그리드 또는 창의 가장자리에 테이프의 조각을 적용 핀셋을 사용합니다. 안전하게 개구 창 자체를 덮는없이 접착 충분히 사용한다. 핀셋 접착 테이프를 조작, 배양 접시의 바닥에 내려 창을 설정합니다. 단단히 배양 접시의 바닥에 테이프를 부착 핀셋의 끝을 사용합니다. </li><li> 다른 가장자리에 다른 테이프 스트립을 적용하고 단단히 핀셋의 끝이 바닥에이를 준수합니다. </li><li> 일단 모든 창문은테이프, 자외선 (UV) 방사선 배양 접시에서 창을 소독. 약 1 시간 동안 층류 후드에서 UV 램프 아래에서 요리를 배치함으로써이 작업을 수행. </li><li> 윈도우 폴리 리신으로 미리 코팅 될 경우 (선택)이므로, 윈도우는 다음의 멸균 않는다. 코트는 10 37 ° C 배양기에서 1 시간 동안 멸균 된 0.01 %의 폴리 -L- 라이신 솔루션의 μL와 함께 창은 문화 미디어로 남아있는 솔루션을 씻어 낸다. </li></ol></li><li> XFM 전에 최종 세척을위한 버퍼를 준비합니다. <ol><li> 트리스 글루코스 또는 피페 라진 N를 준비, N &#39;비스 (에탄 설 폰산) (PIPES)는 칼슘 및 마그네슘없는 둘 베코 인산염 완충 식염수 (D-PBS)로 삼투압과 pH를 동등한 임의의 미량 금속이없는 버퍼 -sucrose. 세포를 화학적으로 고정 후 세포를 씻어 이러한 버퍼 중 하나를 사용합니다. <ol><li> 트리스 포도당 용액 (10 mM 트리스, 260 mM의 혈당, 9 mM의 아세트산을) 만들 포도당 1.4 g, 트리스베이스 36 mg을 추가하고,초순수에 20 ㎖의 아세트산을 16 μL. 그런 다음, 초순수 30 ml의 최종 볼륨을 조정합니다. 어떤 pH 조정이 필요하지 않습니다. 최대 일주에 실온에서 보관하십시오. </li><li> PIPES-수크로오스 (20 밀리미터 PIPES, 200 mM의 수크로오스가) PIPES 0.18 g과 초순수 20㎖를 수크로오스 2.0 g을 추가하고, 농축 아세트산 소량으로 7.4의 pH를 조절할 수 있도록한다. 그런 다음, 초순수 30 ml의 최종 볼륨을 조정합니다. 최대 일주에 실온에서 보관하십시오. 참고 : 마지막 헹굼에 PBS의 사용을 피하는 이유는 PBS 인산, 염화 칼륨의 농도가 완전히 공기 건조하기 전에 제거되지 않는 경우가 XFM을 방해 할 수 있도록 높은 것입니다. </li></ol></li></ol></li><li> 셀 도금 용 버퍼를 준비합니다. <ol><li> 준비 또는 RPMI 배지 1640 모든 미디어를 꺼내, 1X 트립신 EDTA 솔루션, D-PBS, 정상적으로 부착 세포 O를 계대에 대해 수행되어야하는 것처럼 특정 부착 세포주에 필요한 다른 시약F이자, 37 ° C로 예열. </li></ol></li></ol> 세포의 2. 도금 <ol><li> 층류 후드에있는 창을 포함하는 멸균 배양 접시에 살짝 기울어 져 그것으로 배양 접시의 측면을 따라, 미디어 (100mm 배양 접시에 10 ㎖)에 추가합니다. 불필요한 표면 장력을 생성 또는 질화규소 윈도우의 표면에 직접 떨어지지 않도록 매체. 미디어가 추가됨에 따라, 서서히 도포하는 경사각에게 미디어 그리드 및 창을 완화. </li><li> trypsinizing 또는 세포주를 계대를 위해 평소와 같이 판 떨어져 세포를 긁어 적절하게 관심의 부착 세포주를 준비합니다. 신선한 판에 세포를 적용하기 전에 필요한 셀 카운팅, 또는 다른 준비를 수행합니다. </li><li> 일반적으로 24-72 시간 이내에 50 % -70 % 합류에 도달하는데 필요한 세포 밀도로 창문 배양 접시에 세포를 추가하고, 5 % 이산화탄소 배양기에서 가습 37 ° C에서 배양한다. </리&gt; <li> 원하는 세포 밀도 때까지 (보통 50 % -70 %의 합류)에 도달 할 때, 거꾸로 광학 현미경을 사용하여, 때때로 세포의 성장을 관찰한다. </li></ol> 세포의 3. 고정 <ol><li> 구매 한 콘텐츠 (예를 들면 25 % 파라 포름 알데히드)을 희석하고 (시료에 과량의 나트륨을 첨가 회피) 아세트산으로 pH를 7.4로 조정하여 D-PBS 신선한 4 % 파라 포름 알데히드를 준비한다. </li><li> 세포가 원하는대로 성장되었습니다 (예 : Hoescht 등) 어떤 중요한 얼룩 적용 군데되었을 때, 한 손으로 45 ° 각도로 접시를 기울이기, 부드러운 흡인하여 미디어를 제거하고 다른 손 피펫으로 흡입 . 참고 : 대신 피펫 보냈다 미디어, 대안은 창을 집어 두 번 D-PBS와 마이크로 원심 튜브에 창을 찍어 다음 PBS 세척의 2 번 다음에 20 분 동안 고정액 솔루션과 새로운 문화 용기에 배치하는 것입니다 잔류 고정 제를 제거합니다. 이 선택하면, DIR 이동ectly 3.5 단계. </li><li> D-PBS로 부드럽게 접시를 씻어 접시의 측면을 향해 45도 각도로 피펫을 접시를 잡고 부드럽게 신선한 4 % PFA / PBS를 추가, 천천히 허용 경사각을 완화하여 즉시 제거 된 액체를 교체 정착액 솔루션은 윈도우를 포함한다. 실온에서 20 분 동안 고정액으로 덮여 세포 보관하십시오. </li><li> 약간 접시를 기울 손으로 흡입, 위와 같이 다시, 부드러운 흡인하여 액체를 제거합니다. </li><li> 부드럽게, 파이프 / 자당 용액의 일부를 추가하는 단계 3.3에 설명 된 틸팅 및 피펫 팅 방법을 사용하여 제거 된 액체를 교체합니다. </li><li> 반복 3.4 및 3.5 단계를 반복합니다. </li><li> 건조 재료를 준비합니다. <ol><li> 이러한 Kimwipes로 보풀이없는 수건을 수집하고, 매우 빠르고 쉽게 편리 있도록 박스의 밖으로 당깁니다. </li><li> 윈도우가 건조 설정하는 깨끗하고 레벨이 아닌 장소를 준비합니다. 능선을 따라서이 전자 현미경에 사용되는 종류의 고무 그리드 매트를 설정이 마를 때 창이 한쪽에 누워 할 수 있습니다. 이는 건조로 건조 표면에 갇히지에서 윈도우를 유지하고, 시료의 나머지 가장자리 버퍼 드레인 것이다. </li></ol></li><li> 조심스럽게 액체에서 창을 개최 창에 부착 된 테이프를 tweeze. 역방향 핀셋을 따기 다음 그들을 떠 갈 수있는 파이프 / 자당의 작은 금액을 적용하고하여 테이프를 벗겨 질 창을 검색합니다. </li><li> 조심스럽게 철저하게 (창 자체를 건드리지 않고) 킴과 윈도우의 가장자리에서 초과 파이프 / 크로스를 바르기. 또한 킴 와이프의 둥근 배를 이용하여 다시 들여 영역을 바르기. 주 : 목표는 가능한 한 윈도우의 표면 상에 염 또는 버퍼의 결정화를 적게하는 것이다. </li><li> 그리드 매트에 창을 놓습니다. 창은 격자 매트에 평평하게 누워 있지 않은지 확인하지만, (그리드 매트의 능선을 사용)과 그리드의 한 작은 감동 가장자리에 누워가능한 매트. 윈도우를 건조 시키십시오. </li></ol> 4. 샘플 장착 및 이미지 <ol><li> 샘플이 건조되면, 광학 현미경을 사용하여 Windows에 세포의 존재를 확인합니다. 싱크로트론에 전송을 위해 샘플을 준비하기 전에,이 검증을 수행합니다. </li><li> 실험을 호스팅하는 싱크로트론 빔라인 교통을위한 창을 패키지로 제공된다. 부드럽게 한 다음, 유리 슬라이드 상에 양면 테이프를 부착 윈도우 플라스틱 페트리 접시의 바닥에 테이프로 유리 슬라이드에 부착. 페트리 접시 다물고 테이프입니다. 참고 : 이전에이 시점에, 다음 단계는 어떤 일반적인 실험실에서 수행 될 수있다. 다음 단계는 가장 싱크로트론 빔라인에서 수행 될 것이다. </li><li> 핀셋으로 조심스럽게 창에서 테이프를 제거합니다. 싱크로트론에서 빔라인 협력자가 제공 알루미늄 홀더에 창을 고정, 창 가장자리의 얇은 코팅조차, 매니큐어를 사용한다. </li><li> 에 알루미늄 홀더를 삽입운동 마운트 한 다음 X 선 현미경의 위치에 놓습니다. 빔라인에서 샘플 챔버 내부 동력 단계에 연결 브래킷의 샘플을 탑재합니다. </li><li> 샘플 X 선 현미경 악기 영역 (납 채워진 벽을 만든 허치), 설치 검사를 종료 한 후. 비디오 십자선과 장착 카메라를 사용하여 샘​​플을 X 선 빔의 위치를​​ 확인하면서, 스캔 샘플의 해당 영역을 선택, 빔라인 특정 소프트웨어를 사용하여 사전 정렬 하류 신틸 카메라. </li><li> 관심있는 피쳐의 가장 작은 크기의 추정치에 기초하여 시료에 적합한 해상도를 선택한다. 하나의 포유 동물 세포를 이미징 (~ 크기가 20 ~ 40 μm의)는 0.25-0.5 ㎛의 해상도를 사용합니다. 조직의 촬상 영역, 및 서로로부터 셀을 구분하기위한 층, 2-20 ㎛의 해상도를 사용한다. </li><li> met의 양의 추정치에 기초하여 상기 샘플의 적절한 체류 시간을 선택관심 존재의 알. 금속의 높은 양이있는 경우에는 간략하게 검사를 위해 또는 픽셀 당 30 ~ 300 밀리의 체류 시간과 비행 검사를 사용합니다. 작은 물질이 존재하는 경우, 또는, 상대적으로 낮은 풍요의 금속을 측정 픽셀 당 1 ~ 2 초의 체류 시간과 단계 검사를 사용합니다. </li><li> 빔라인 특정 소프트웨어로 스캔을 프로그래밍합니다. 래스터 스캔 이미지를 획득. 각 요소에 대해 특징적인 피크 에너지를 식별하는 소프트웨어와 데이터를 분석하는 빔라인 협력자 함께 작업. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

X 선 형광 이미징은 지구과학, 재료 과학, 화학 생물학 26-34 등 많은 분야에서 유용하다. 싱크로트론 X- 레이의 발전, 그리고 그들의 초점은 매우 강도 높은 빔을 생산. 집중 X 선은 현재 이용 가능한 실리콘 드리프트 검출기 기술로 측정 할 수있다 신호를 생성하는 현재 존재하는 세포에서 내인성 금속을 자극하기에 충분한 광선. 그리고 셀 내에서 금속의 화학 생물학을 연구하는 것은이 분?...

형광 이미징은 정체성과 샘플에 존재하는 원소의 양을 모두 허용 X 선은 공간적으로 해결한다. 입사 X 선은, 주목 무거운 요소의 결합 에너지 전자보다 크도록 선택된 에너지, 핵 (1)에 내측 쉘 전자의 결합 에너지를 극복. 이 전자 껍질에 &#39;구멍&#39;을 만듭니다. 높은 에너지의 전자가이 구멍으로 아래로 떨어질 때, 형광 X 선 파장이 그 궤도의 에너지 분리에 의존 방출된다. 오비탈의 에너지 간격은 주어진 요소의 특징이기 때문에, X 선 형광 발광 소자는 파장에 의존하는 특성을 갖는다. 그것은 본 요소의 식별을 허용 특성이 파장에서 발광된다. 형광 강도의 보정은 본 소자의 정량을 허용한다. X 선 형광 microscopY (XFM)는 부분적으로 같은 봄-8 일본, 유럽 방사선 싱크로 시설 프랑스 (ESRF) 및 고급 광자 소스 (의 것과 매우 화려한 X 선 싱크로트론 소스의 개발, 점점 더 활용되고있다 미국 2 APS). 이 소스는 매우 높은 강도의 X 선 빔을 제공한다. 동시에, 이러한 존 플레이트 기술과 같은 X 선 광학 개선은 다소 비효율적 3이라도 서브 마이크론 이러한 스폿 빔의 포커싱을 허용했다. 매우 고강도 빔, 현재 이용 가능한 기술을 검출기로 측정 할 수있는 세포에서 내인성 금속을 자극하기에 충분하다 집중 될 수 광의 심지어 비교적 소량 생산 신호. 따라서, 셀에서 금속의 화학 생물학을 연구하는 것은이 기술 4-10 최근 개발 많은 이용한다 특히 하나의 애플리케이션이다. 앱 동안 고려해야 할 많은 중요한 요소가 있습니다XFM을 누워 배양 된 포유 동물 세포 또는 다른 생물학적 시료의 원소 분포와 정량화를 조사합니다. 첫째, 샘플은 의미있는 것으로 측정 위해서는, 모두 구조적 및 원소 조성에 대하여, 그대로 유지되어야한다. 그것이 집광 X 선 빔에 의해 야기 될 수 방사선 손상에 강건한되도록 둘째, 표본은 어떠한 방법으로 보존되어야한다. 시료가 한 번에 이러한 기준을 모두 만족시킬 수있는 한 가지 방법은 급속 유리체, 비결정질 얼음 11,12으로 고정된다는 것이다. 급속 동결은 종종 플 런지 동결 또는 높은 압력이 13 ~ 16 동결 등 다양한 냉동 보존 기술을 통해 달성된다. 그것은 일반적으로 냉동 보존이 가능한 원시 상태에 가까운 생물학적 샘플에서 전체 세포의 구조와 화학 성분을 보존하는 것이 허용됩니다. 세포 및 조직 내로의 고정 제 느리고 침투로 인한 선택적 한편 화학 고정, w로서엘 막 투과성과 같은 이후의 변화는 다양한 세포 이온 특히 CL, 칼슘과 K로 확산 이온 따라서 17 ~ 19 차선의 이러한 요소의 조사를 렌더링, 침출 손실 또는 이전 할을 허용 할 수있다. 특히 부착 포유 동물 세포의 일반적인 화학 고정, 이상 극저온 고정의 분명한 이점에도 불구하고, 동결 보존은 다양한 한계 20-23있다. 가장 눈에 띄는 사람은 없습니다 모든 연구소가 냉동 보존 장비에 쉽게 접근 할 수 있다는 것입니다. 심지어 현재 대부분의 고압 냉장고 또는 냉동고는 지금까지 세포가 배양되는 곳에서 할 수있다 냉동 시설의 부분 집합에 의해 비용과 소유 뛰어 들다. 냉동 보존의 장점은 셀에 배치 여행 스트레스의 단점과 교환 될 수 있습니다. 동결 반드시 X 선 형광 분석을위한 샘플을 보존하는 방식으로 가장 엄격한 동안 따라서, 확실히 모든 상황에서 모든 연구에 가장 접근 아니다;않으며 항상 필수적인 - 관심 금속 단단히 고정 가능한 거대 분자에 결합하고, 샘플을 이미지화 된 해상도가 건조시 발생할 수있는 초 미세의 손상보다 큰 경우. 주의 사항 24 염두에, 화학 고정 및 건조는 적절한 선택이 될 수 있습니다. 성공적인 X-ray 형광 이미징 실험에서 다른 요소는 적절한 분석을 포함한다. X 선 형광 촬상 근본적 공간 해상도를 제공하기 위해 래스터 주사와 함께 X-ray 형광 발광 스펙트럼이다. 수집 된 X 선 형광 방출 스펙트럼은 발광 피크, 배경, 및 입사 빔의 탄성 및 비탄성 산란 피크를 겹치는 조합을 함유한다. 이러한 기여 디 컨벌루션 및 발광 피크 피팅 가능 소프트웨어는이 필드 (25)에 중요한 발달이었다. 또한, 개발 및 상업적인 DIST재료 수량 형광 강도 상대적인 보정하는 공지 된 조성물의 박막 표준 ribution도 매우 중요했다. 이 프로토콜은 화학적 고정 및 공기 건조 부착 세포의 제조에 대한 설명을 제공한다. 이 과정에서 중요한 단계는 종종 성공에 특정 패션 키에 부드러운 세정을 잘 준수하지 않는 실리콘 질화물 윈도우에있는 세포의 성장이다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="924">
	<tbody>
		<tr height="231">
			<td height="231" style="height:231px;width:216px;">silicon nitride windows</td>
			<td style="width:423px;">Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom</td>
			<td style="width:119px;">No part numbers available. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm.&#160; Thickness 500 nm.&#160; Frame size: 5 mm x 5 mm.&#160; Frame thickness: 200 &#181;m</td>
			<td style="width:167px;">Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc.West Chester, PA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">reverse tweezers</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">78520-5X</td>
			<td style="width:167px;">EMS 5X, NC &#8211; Ultra Fine Tweezers</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">rubber grid mat</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">71170</td>
			<td style="width:167px;">Round Grid Mat</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">acetic acid</td>
			<td style="width:423px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td>
			<td style="width:119px;">338826</td>
			<td style="width:167px;">trace metals grade concentrated acetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PIPES buffer</td>
			<td style="width:423px;">Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td>
			<td style="width:119px;">P6757</td>
			<td style="width:167px;">solid PIPES buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">formaldehyde stock solution</td>
			<td style="width:423px;">Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td>
			<td style="width:119px;">RT 17113</td>
			<td style="width:167px;">10 x 10mL ampules of 20% aqueous paraformaldehyde</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparing adherent cells for x-ray fluorescence imaging by chemical fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

생물학적 시료에 대한 정보를 제공하는 X 선 형광 영상의 능력은 이들 샘플들은 실험의 시간 규모에서 방사선 손상에 견고 이러한 방식으로 제조되는 달려 있으며, 아직 그들의 화학적 및 구조적 특징은 잘 아르 보존. 정착은 셀의 이러한 측면을 (도 1)를 보존 나타내는 - 전술 한 바와 같이 제조 및 묘화 된 시료의 결과를보고에서는, 본 소자의 변동이 있음을 볼 수있다. <p class="jove_...

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Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

화학 고정하여 X-ray 형광 이미징 부착 세포를 준비

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

9.3K 조회수.  Argonne National Laboratory. Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays. 

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A Simple and Rapid Protocol for Measuring Neutral Lipids in Algal Cells Using Fluorescence

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal fermentation processes and screening for new oil-rich strains requires a fast and reliable protocol for determination of intracellular lipid content. Current practices rely largely on gravimetric methods to determine oil content, techniques developed decades ago that are time consuming and require large sample volumes. In this paper, Nile Red, a fluorescent dye that has been used to identify the presence of lipid bodies in numerous types of organisms, is incorporated into a simple, fast, and reliable protocol for measuring the neutral lipid content of Auxenochlorella protothecoides, a green alga. The method uses ethanol, a relatively mild solvent, to permeabilize the cell membrane before staining and a 96 well micro-plate to increase sample capacity during fluorescence intensity measurements. It has been designed with the specific application of monitoring bioprocess performance. Previously dried samples or live samples from a growing culture can be used in the assay.

A simple protocol to determine the neutral lipid content of algal cells using a Nile Red staining procedure is described. This time-saving technique offers an alternative to traditional gravimetric-based lipid quantification protocols. It has been designed for the specific application of monitoring bioprocess performance.

형광을 사용하여 조류 세포에서 중성 지질을 측정하기위한 간단하고 빠른 프로토콜

Algae are considered excellent candidates for renewable fuel sources due to their natural lipid storage capabilities. Robust monitoring of algal ...

연구

화학

X-ray Powder Diffraction in Conservation Science: Towards Routine Crystal Structure Determination of Corrosion Products on Heritage Art Objects

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder diffraction (XRPD) is presented in detail via two case studies.
The first material under investigation was sodium copper formate hydroxide oxide hydrate, Cu4Na4O(HCOO)8(OH)2&#8729;4H2O (sample 1) which forms on soda glass/copper alloy composite historic objects (e.g., enamels) in museum collections, exposed to formaldehyde and formic acid emitted from wooden storage cabinets, adhesives, etc. This degradation phenomenon has recently been characterized as &#34;glass induced metal corrosion&#34;.
For the second case study, thecotrichite, Ca3(CH3COO)3Cl(NO3)2&#8729;6H2O (sample 2), was chosen, which is an efflorescent salt forming needlelike crystallites on tiles and limestone objects which are stored in wooden cabinets and display cases. In this case, the wood acts as source for acetic acid which reacts with soluble chloride and nitrate salts from the artifact or its environment.
The knowledge of the geometrical structure helps conservation science to better understand production and decay reactions and to allow for full quantitative analysis in the frequent case of mixtures.

Modern high resolution X-ray powder diffraction (XRPD) in the laboratory is used as an efficient tool to determine crystal structures of long-known corrosion products on historic objects.

보존 과학의 X 선 분말 회절 : 문화 예술에 부식 제품의 일상적인 결정 구조 결정을 향해

The crystal structure determination and refinement process of corrosion products on historic art objects using laboratory high-resolution X-ray powder ...

Quantifying X-Ray Fluorescence Data Using MAPS

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical composition and elemental distribution within a material. Synchrotron-based XRF has become an integral characterization technique for a variety of research topics, particularly due to its non-destructive nature and its high sensitivity. Today, synchrotrons can acquire fluorescence data at spatial resolutions well below a micron, allowing for the evaluation of compositional variations at the nanoscale. Through proper quantification, it is then possible to obtain an in-depth, high-resolution understanding of elemental segregation, stoichiometric relationships, and clustering behavior.
This article explains how to use the MAPS fitting software developed by Argonne National Laboratory for the quantification of full 2-D XRF maps. We use as an example results from a Cu(In,Ga)Se2 solar cell, taken at the Advanced Photon Source beamline 2-ID-D at Argonne National Laboratory. We show the standard procedure for fitting raw data, demonstrate how to evaluate the quality of a fit and present the typical outputs generated by the program. In addition, we discuss in this manuscript certain software limitations and offer suggestions for how to further correct the data to be numerically accurate and representative of spatially resolved, elemental concentrations.

Here, we demonstrate the use of the X-ray fluorescence fitting software, MAPS, created by Argonne National Laboratory for the quantification of fluorescence microscopy data. The quantified data that results is useful for understanding the elemental distribution and stoichiometric ratios within a sample of interest.

지도 사용 하 여 x 선 형광 데이터 측정

The quantification of X-ray fluorescence (XRF) microscopy maps by fitting the raw spectra to a known standard is crucial for evaluating chemical ...

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The devices are patterned from epoxy glue using soft lithography and are suitable for in situ X-ray diffraction experiments at room temperature. The sample wells are lidded on both sides with polymeric polyimide foil windows that allow diffraction data collection with low X-ray background. This fabrication method is undemanding and inexpensive. After the sourcing of a SU-8 master wafer, all fabrication can be completed outside of a cleanroom in a typical research lab environment. The chip design and fabrication protocol utilize capillary valving to microfluidically split an aqueous reaction into defined nanoliter sized droplets. This loading mechanism avoids the sample loss from channel dead-volume and can easily be performed manually without using pumps or other equipment for fluid actuation. We describe how isolated nanoliter sized drops of protein solution can be monitored in situ by dynamic light scattering to control protein crystal nucleation and growth. After suitable crystals are grown, complete X-ray diffraction datasets can be collected using goniometer based in situ fixed target serial X-ray crystallography at room temperature. The protocol provides custom scripts to process diffraction datasets using a suite of software tools to solve and refine the protein crystal structure. This approach avoids the artefacts possibly induced during cryo-preservation or manual crystal handling in conventional crystallography experiments. We present and compare three protein structures that were solved using small crystals with dimensions of approximately 10-20 &#181;m grown in chip. By crystallizing and diffracting in situ, handling and hence mechanical disturbances of fragile crystals is minimized. The protocol details how to fabricate a custom X-ray transparent microfluidic chip suitable for in situ serial crystallography. As almost every crystal can be used for diffraction data collection, these microfluidic chips are a very efficient crystal delivery method.

Microfluidic Chips for In Situ Crystal X-ray Diffraction and In Situ Dynamic Light Scattering for Serial Crystallography

This protocol describes in detail how to fabricate and operate microfluidic devices for X-ray diffraction data collection at room temperature. Additionally, it describes how to monitor protein crystallization by dynamic light scattering and how to process and analyze obtained diffraction data.

현장에서 크리스탈 x-선 회절 및 현장에서 직렬 결정학에 대 한 동적 빛 산란에 대 한 미세 칩

This protocol describes fabricating microfluidic devices with low X-ray background optimized for goniometer based fixed target serial crystallography. The ...

Essential Metal Uptake in Gram-negative Bacteria: X-ray Fluorescence, Radioisotopes, and Cell Fractionation

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for the purpose of biophysical characterization, and measure substrate transfer between periplasmic and cytoplasmic compartments. By carefully limiting the time that the periplasm is separated from the cytoplasm, the experimenter can extract the protein of interest and assay each compartment individually for substrate without carry-over contamination between compartments. The extracted protein from fractionation can then be further analyzed for three-dimensional structure determination or substrate-binding profiles. Alternatively, this method can be performed after incubation with a radiotracer to determine total percent uptake, as well as distribution of the tracer (and hence metal transport) across different bacterial compartments. Experimentation with a radiotracer can help differentiate between a physiological substrate and artefactual substrate, such as those caused by mismetallation.
X-ray fluorescence can be used to discover the presence or absence of metal incorporation in a sample, as well as measure changes that may occur in metal incorporation as a product of growth conditions, purification conditions, and/or crystallization conditions. X-ray fluorescence also provides a relative measure of abundance for each metal, which can be used to determine the best metal energy absorption peak to use for anomalous X-ray scattering data collection. Radiometal uptake can be used as a method to validate the physiological nature of a substrate detected by X-ray fluorescence, as well as support the discovery of novel substrates.

A protocol for the extraction of a periplasmic transition metal chaperone in the context of its native binding partners, and biophysical characterization of its substrate contents by X-ray fluorescence and radiometal uptake is presented.

그램 음성 박테리아에 필수 금속 통풍 관: 형광, Radioisotopes, x 선 및 세포 분별 법

We demonstrate a scalable method for the separation of the bacterial periplasm from the cytoplasm. This method is used to purify periplasmic protein for ...

Elemental-sensitive Detection of the Chemistry in Batteries through Soft X-ray Absorption Spectroscopy and Resonant Inelastic X-ray Scattering

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid based on volatile solar and wind sources. The pressing demand of developing high-performance electrochemical energy storage solutions, i.e., batteries, relies on both fundamental understanding and practical developments from both the academy and industry. The formidable challenge of developing successful battery technology stems from the different requirements for different energy-storage applications. Energy density, power, stability, safety, and cost parameters all have to be balanced in batteries to meet the requirements of different applications. Therefore, multiple battery technologies based on different materials and mechanisms need to be developed and optimized. Incisive tools that could directly probe the chemical reactions in various battery materials are becoming critical to advance the field beyond its conventional trial-and-error approach. Here, we present detailed protocols for soft X-ray absorption spectroscopy (sXAS), soft X-ray emission spectroscopy (sXES), and resonant inelastic X-ray scattering (RIXS) experiments, which are inherently elemental-sensitive probes of the transition-metal 3d and anion 2p states in battery compounds. We provide the details on the experimental techniques and demonstrations revealing the key chemical states in battery materials through these soft X-ray spectroscopy techniques.

Here, we present a protocol for typical experiments of soft X-ray absorption spectroscopy (sXAS) and resonant inelastic X-ray scattering (RIXS) with applications in battery material studies.

소프트 x 선 흡수 분광학 및 공명 탄력 x 선 산란을 통해 배터리에 화학의 원소 구분 검색

Energy storage has become more and more a limiting factor of today's sustainable energy applications, including electric vehicles and green electric grid ...

Analysis of Minerals Produced by hFOB 1.19 and Saos-2 Cells Using Transmission Electron Microscopy with Energy Dispersive X-ray Microanalysis

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in vesicles released by two human bone cell lines: hFOB 1.19 and Saos-2. These cell lines, after treatment with ascorbic acid (AA) and &#946;-glycerophosphate (&#946;-GP), undergo complete osteogenic transdifferentiation from proliferation to mineralization and produce matrix vesicles (MVs) that trigger apatite nucleation in the extracellular matrix (ECM).
Based on Alizarin Red-S (AR-S) staining and analysis of the composition of minerals in cell lysates using ultraviolet (UV) light or in vesicles using TEM imaging followed by EDX quantitation and ion mapping, we can infer that osteosarcoma Saos-2 and osteoblastic hFOB 1.19 cells reveal distinct mineralization profiles. Saos-2 cells mineralize more efficiently than hFOB 1.19 cells and produce larger mineral deposits that are not visible under UV light but are similar to hydroxyapatite (HA) in that they have more Ca and F substitutions.
The results obtained using these techniques allow us to conclude that the process of mineralization differs depending on the cell type. We propose that, at the cellular level, the origin and properties of vesicles predetermine the type of minerals.

We present a protocol to compare the state of minerals in vesicles released by two human bone cell lines: hFOB 1.19 and Saos-2. Their mineralization profiles were analyzed by Alizarin Red-S (AR-S) staining, ultraviolet (UV) light visualization, transmission electron microscopy (TEM) imaging and energy dispersive X-ray microanalysis (EDX).

미네랄 hFOB 1.19에 의해 생산 및 Saos-2 세포를 사용 하 여 전송 전자 현미경 에너지 흩어진 엑스레이 Microanalysis와 분석

This video presents the use of transmission electron microscopy with energy dispersive X-ray microanalysis (TEM-EDX) to compare the state of minerals in ...

Ligand-Mediated Nucleation and Growth of Palladium Metal Nanoparticles

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution of capping ligands during the synthesis reaction, their role in regulating the nucleation and growth rates of colloidal nanoparticles is not well understood. In this work, we demonstrate a mechanistic investigation of the role of trioctylphosphine (TOP) in Pd nanoparticles in different solvents (toluene and pyridine) using in situ SAXS and ligand-based kinetic modeling. Our results under different synthetic conditions reveal the overlap of nucleation and growth of Pd nanoparticles during the reaction, which contradicts the LaMer-type nucleation and growth model. The model accounts for the kinetics of Pd-TOP binding for both, the precursor and the particle surface, which is essential to capture the size evolution as well as the concentration of particles in situ. In addition, we illustrate the predictive power of our ligand-based model through designing the synthetic conditions to obtain nanoparticles with desired sizes. The proposed methodology can be applied to other synthesis systems and therefore serves as an effective strategy for predictive synthesis of colloidal nanoparticles.

The main goal of this work is to elucidate the role of capping agents in regulating the size of palladium nanoparticles by combining in situ small angle x-ray scattering (SAXS) and ligand-based kinetic modeling.

Ligand 중재 Nucleation 및 팔라듐 금속 나노 입자의 성장

The size, size distribution and stability of colloidal nanoparticles are greatly affected by the presence of capping ligands. Despite the key contribution ...

Improving High Viscosity Extrusion of Microcrystals for Time-resolved Serial Femtosecond Crystallography at X-ray Lasers

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray free electron lasers (XFELs). A series of experiments using the light-driven proton pump bacteriorhodopsin have further established these injectors as a preferred option to deliver crystals for time-resolved serial femtosecond crystallography (TR-SFX) to resolve structural changes of proteins after photoactivation. To obtain multiple structural snapshots of high quality, it is essential to collect large amounts of data and ensure clearance of crystals between every pump laser pulse. Here, we describe in detail how we optimized the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals for our recent TR-SFX experiments at the Linac Coherent Light Source (LCLS). The goal of the method is to optimize extrusion for a stable and continuous flow while maintaining a high density of crystals to increase the rate at which data can be collected in a TR-SFX experiment. We achieve this goal by preparing lipidic cubic phase with a homogenous distribution of crystals using a novel three-way syringe coupling device followed by adjusting the sample composition based on measurements of the extrusion stability taken with a high-speed camera setup. The methodology can be adapted to optimize the flow of other microcrystals. The setup will be available for users of the new Swiss Free Electron Laser facility.

The success of a time-resolved serial femtosecond crystallography experiment is dependent on efficient sample delivery. Here, we describe protocols to optimize the extrusion of bacteriorhodopsin microcrystals from a high viscosity micro-extrusion injector. The methodology relies on sample homogenization with a novel three-way coupler and visualization with a high-speed camera.

X 선 레이저에서 직렬 펨 결정학 시간 해결에 대 한 Microcrystals의 고 점도 압출을 개선

High-viscosity micro-extrusion injectors have dramatically reduced sample consumption in serial femtosecond crystallographic experiments (SFX) at X-ray ...

Biological Samples Preparation for Speciation at Cryogenic Temperature using High-Resolution  X-Ray Absorption Spectroscopy

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample preparation is a key and often complex procedure, particularly for biological samples. Although X-ray speciation techniques are widely used, no detailed protocol has been yet disseminated for users of the technique. Further, chemical state modification is of concern, and cryo-based techniques are recommended to analyze the biological samples in their near-native hydrated state to provide the maximum preservation of chemical integrity of the cells or tissues. Here, we propose a cellular preparation protocol based on cryo-preserved samples. It is demonstrated in a high energy resolution fluorescence detected X-ray absorption spectroscopy study of selenium in cancer cells and a study of iron in phytoplankton. This protocol can be used with other biological samples and other X-ray techniques that can be damaged by irradiation.

This protocol presents a detailed procedure to prepare biological cryosamples for synchrotron-based X-ray absorption spectroscopy experiments. We describe all the steps required to optimize sample preparation and cryopreservation with examples of the protocol with cancer and phytoplankton cells. This method provides a universal standard of sample cryo-preparation.

고분해능 X선 흡수 분광법을 이용한 극저온에서의 종분화를 위한 생물학적 시료 준비

The study of elements with X-ray absorption spectroscopy (XAS) is of particular interest when studying the role of metals in biological systems. Sample ...