Name: preparing adherent cells for x-ray fluorescence imaging by chemical fixation
Uploaded: 2015-03-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
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The authors acknowledge Stefan Vogt for his assistance in the fitting of the representative data shown in this paper, and helpful discussions. The authors also acknowledge Chris Jacobsen for his support to Q. J. 
Use of the Advanced Photon Source, beamlines 2-ID-E and 8-BM-B, at Argonne National Laboratory was supported by the U. S. Department of Energy, Office of Science, Office of Basic Energy Sciences, under Contract No. DE-AC02-06CH11357.

악기, 기판, 문화 미디어와 요리 1. 준비 <ol><li> 실리콘 나이트 (시 3 N 4) 윈도우의 취급. <ol><li> 한편으로 캡슐의 타단을 회전시키면서 약간 창 자체 짜지하는 방식으로 윈도우를 함유 한 단부를 압착하여 캡슐을 연다. </li><li> 역의 쌍을 확인, 실체 현미경 아래 뾰족한 핀셋 끝에 접착제, 틈새 나 굴곡이 없는지 확인합니다. 그렇지 않으면, 창은 핀셋으로 파손 또는 후속 단계에서 그들을 떨어져 비행 할 수있다. </li><li> 부드럽게 윈도우의 가장자리가 나올 필요로하는 곳에 캡슐을 넓게 할 수 있도록하는 방향으로 압력을 개방 끝 부분에 캡슐을 압박하면서, 조심스럽게 핀셋 윈도우의 프레임을 잡고 캡슐에서 창을 제거합니다. </li></ol></li><li> 창 미리 세척 (선택 사항). <ol><li> 부드럽게를 담그고, 미리 세척 창을 원하는 경우70 % 에탄올에서 2 분 세척 100 % 에탄올에서 2 분 세척 한 다음 5 초 동안 증류수에. </li></ol></li><li> 부착 및 배양 접시에 창을 살균. <ol><li> 창문을 부착하기 위해, 배양 접시의 바닥에 평평한면을 위로해서 창을 설정, 깨끗한 유리 슬라이드에 테이프의 조각을 배치합니다. 테이프의 긴 측면 아래 기장 스트립을 약 잘라. 깨끗한 면도날 ( &quot;¾에 의해&quot;⅛에서) 짧은 측 떨어져 테이프의 조각을 가져 가라. </li><li> 그리드 또는 창의 가장자리에 테이프의 조각을 적용 핀셋을 사용합니다. 안전하게 개구 창 자체를 덮는없이 접착 충분히 사용한다. 핀셋 접착 테이프를 조작, 배양 접시의 바닥에 내려 창을 설정합니다. 단단히 배양 접시의 바닥에 테이프를 부착 핀셋의 끝을 사용합니다. </li><li> 다른 가장자리에 다른 테이프 스트립을 적용하고 단단히 핀셋의 끝이 바닥에이를 준수합니다. </li><li> 일단 모든 창문은테이프, 자외선 (UV) 방사선 배양 접시에서 창을 소독. 약 1 시간 동안 층류 후드에서 UV 램프 아래에서 요리를 배치함으로써이 작업을 수행. </li><li> 윈도우 폴리 리신으로 미리 코팅 될 경우 (선택)이므로, 윈도우는 다음의 멸균 않는다. 코트는 10 37 ° C 배양기에서 1 시간 동안 멸균 된 0.01 %의 폴리 -L- 라이신 솔루션의 μL와 함께 창은 문화 미디어로 남아있는 솔루션을 씻어 낸다. </li></ol></li><li> XFM 전에 최종 세척을위한 버퍼를 준비합니다. <ol><li> 트리스 글루코스 또는 피페 라진 N를 준비, N &#39;비스 (에탄 설 폰산) (PIPES)는 칼슘 및 마그네슘없는 둘 베코 인산염 완충 식염수 (D-PBS)로 삼투압과 pH를 동등한 임의의 미량 금속이없는 버퍼 -sucrose. 세포를 화학적으로 고정 후 세포를 씻어 이러한 버퍼 중 하나를 사용합니다. <ol><li> 트리스 포도당 용액 (10 mM 트리스, 260 mM의 혈당, 9 mM의 아세트산을) 만들 포도당 1.4 g, 트리스베이스 36 mg을 추가하고,초순수에 20 ㎖의 아세트산을 16 μL. 그런 다음, 초순수 30 ml의 최종 볼륨을 조정합니다. 어떤 pH 조정이 필요하지 않습니다. 최대 일주에 실온에서 보관하십시오. </li><li> PIPES-수크로오스 (20 밀리미터 PIPES, 200 mM의 수크로오스가) PIPES 0.18 g과 초순수 20㎖를 수크로오스 2.0 g을 추가하고, 농축 아세트산 소량으로 7.4의 pH를 조절할 수 있도록한다. 그런 다음, 초순수 30 ml의 최종 볼륨을 조정합니다. 최대 일주에 실온에서 보관하십시오. 참고 : 마지막 헹굼에 PBS의 사용을 피하는 이유는 PBS 인산, 염화 칼륨의 농도가 완전히 공기 건조하기 전에 제거되지 않는 경우가 XFM을 방해 할 수 있도록 높은 것입니다. </li></ol></li></ol></li><li> 셀 도금 용 버퍼를 준비합니다. <ol><li> 준비 또는 RPMI 배지 1640 모든 미디어를 꺼내, 1X 트립신 EDTA 솔루션, D-PBS, 정상적으로 부착 세포 O를 계대에 대해 수행되어야하는 것처럼 특정 부착 세포주에 필요한 다른 시약F이자, 37 ° C로 예열. </li></ol></li></ol> 세포의 2. 도금 <ol><li> 층류 후드에있는 창을 포함하는 멸균 배양 접시에 살짝 기울어 져 그것으로 배양 접시의 측면을 따라, 미디어 (100mm 배양 접시에 10 ㎖)에 추가합니다. 불필요한 표면 장력을 생성 또는 질화규소 윈도우의 표면에 직접 떨어지지 않도록 매체. 미디어가 추가됨에 따라, 서서히 도포하는 경사각에게 미디어 그리드 및 창을 완화. </li><li> trypsinizing 또는 세포주를 계대를 위해 평소와 같이 판 떨어져 세포를 긁어 적절하게 관심의 부착 세포주를 준비합니다. 신선한 판에 세포를 적용하기 전에 필요한 셀 카운팅, 또는 다른 준비를 수행합니다. </li><li> 일반적으로 24-72 시간 이내에 50 % -70 % 합류에 도달하는데 필요한 세포 밀도로 창문 배양 접시에 세포를 추가하고, 5 % 이산화탄소 배양기에서 가습 37 ° C에서 배양한다. </리&gt; <li> 원하는 세포 밀도 때까지 (보통 50 % -70 %의 합류)에 도달 할 때, 거꾸로 광학 현미경을 사용하여, 때때로 세포의 성장을 관찰한다. </li></ol> 세포의 3. 고정 <ol><li> 구매 한 콘텐츠 (예를 들면 25 % 파라 포름 알데히드)을 희석하고 (시료에 과량의 나트륨을 첨가 회피) 아세트산으로 pH를 7.4로 조정하여 D-PBS 신선한 4 % 파라 포름 알데히드를 준비한다. </li><li> 세포가 원하는대로 성장되었습니다 (예 : Hoescht 등) 어떤 중요한 얼룩 적용 군데되었을 때, 한 손으로 45 ° 각도로 접시를 기울이기, 부드러운 흡인하여 미디어를 제거하고 다른 손 피펫으로 흡입 . 참고 : 대신 피펫 보냈다 미디어, 대안은 창을 집어 두 번 D-PBS와 마이크로 원심 튜브에 창을 찍어 다음 PBS 세척의 2 번 다음에 20 분 동안 고정액 솔루션과 새로운 문화 용기에 배치하는 것입니다 잔류 고정 제를 제거합니다. 이 선택하면, DIR 이동ectly 3.5 단계. </li><li> D-PBS로 부드럽게 접시를 씻어 접시의 측면을 향해 45도 각도로 피펫을 접시를 잡고 부드럽게 신선한 4 % PFA / PBS를 추가, 천천히 허용 경사각을 완화하여 즉시 제거 된 액체를 교체 정착액 솔루션은 윈도우를 포함한다. 실온에서 20 분 동안 고정액으로 덮여 세포 보관하십시오. </li><li> 약간 접시를 기울 손으로 흡입, 위와 같이 다시, 부드러운 흡인하여 액체를 제거합니다. </li><li> 부드럽게, 파이프 / 자당 용액의 일부를 추가하는 단계 3.3에 설명 된 틸팅 및 피펫 팅 방법을 사용하여 제거 된 액체를 교체합니다. </li><li> 반복 3.4 및 3.5 단계를 반복합니다. </li><li> 건조 재료를 준비합니다. <ol><li> 이러한 Kimwipes로 보풀이없는 수건을 수집하고, 매우 빠르고 쉽게 편리 있도록 박스의 밖으로 당깁니다. </li><li> 윈도우가 건조 설정하는 깨끗하고 레벨이 아닌 장소를 준비합니다. 능선을 따라서이 전자 현미경에 사용되는 종류의 고무 그리드 매트를 설정이 마를 때 창이 한쪽에 누워 할 수 있습니다. 이는 건조로 건조 표면에 갇히지에서 윈도우를 유지하고, 시료의 나머지 가장자리 버퍼 드레인 것이다. </li></ol></li><li> 조심스럽게 액체에서 창을 개최 창에 부착 된 테이프를 tweeze. 역방향 핀셋을 따기 다음 그들을 떠 갈 수있는 파이프 / 자당의 작은 금액을 적용하고하여 테이프를 벗겨 질 창을 검색합니다. </li><li> 조심스럽게 철저하게 (창 자체를 건드리지 않고) 킴과 윈도우의 가장자리에서 초과 파이프 / 크로스를 바르기. 또한 킴 와이프의 둥근 배를 이용하여 다시 들여 영역을 바르기. 주 : 목표는 가능한 한 윈도우의 표면 상에 염 또는 버퍼의 결정화를 적게하는 것이다. </li><li> 그리드 매트에 창을 놓습니다. 창은 격자 매트에 평평하게 누워 있지 않은지 확인하지만, (그리드 매트의 능선을 사용)과 그리드의 한 작은 감동 가장자리에 누워가능한 매트. 윈도우를 건조 시키십시오. </li></ol> 4. 샘플 장착 및 이미지 <ol><li> 샘플이 건조되면, 광학 현미경을 사용하여 Windows에 세포의 존재를 확인합니다. 싱크로트론에 전송을 위해 샘플을 준비하기 전에,이 검증을 수행합니다. </li><li> 실험을 호스팅하는 싱크로트론 빔라인 교통을위한 창을 패키지로 제공된다. 부드럽게 한 다음, 유리 슬라이드 상에 양면 테이프를 부착 윈도우 플라스틱 페트리 접시의 바닥에 테이프로 유리 슬라이드에 부착. 페트리 접시 다물고 테이프입니다. 참고 : 이전에이 시점에, 다음 단계는 어떤 일반적인 실험실에서 수행 될 수있다. 다음 단계는 가장 싱크로트론 빔라인에서 수행 될 것이다. </li><li> 핀셋으로 조심스럽게 창에서 테이프를 제거합니다. 싱크로트론에서 빔라인 협력자가 제공 알루미늄 홀더에 창을 고정, 창 가장자리의 얇은 코팅조차, 매니큐어를 사용한다. </li><li> 에 알루미늄 홀더를 삽입운동 마운트 한 다음 X 선 현미경의 위치에 놓습니다. 빔라인에서 샘플 챔버 내부 동력 단계에 연결 브래킷의 샘플을 탑재합니다. </li><li> 샘플 X 선 현미경 악기 영역 (납 채워진 벽을 만든 허치), 설치 검사를 종료 한 후. 비디오 십자선과 장착 카메라를 사용하여 샘​​플을 X 선 빔의 위치를​​ 확인하면서, 스캔 샘플의 해당 영역을 선택, 빔라인 특정 소프트웨어를 사용하여 사전 정렬 하류 신틸 카메라. </li><li> 관심있는 피쳐의 가장 작은 크기의 추정치에 기초하여 시료에 적합한 해상도를 선택한다. 하나의 포유 동물 세포를 이미징 (~ 크기가 20 ~ 40 μm의)는 0.25-0.5 ㎛의 해상도를 사용합니다. 조직의 촬상 영역, 및 서로로부터 셀을 구분하기위한 층, 2-20 ㎛의 해상도를 사용한다. </li><li> met의 양의 추정치에 기초하여 상기 샘플의 적절한 체류 시간을 선택관심 존재의 알. 금속의 높은 양이있는 경우에는 간략하게 검사를 위해 또는 픽셀 당 30 ~ 300 밀리의 체류 시간과 비행 검사를 사용합니다. 작은 물질이 존재하는 경우, 또는, 상대적으로 낮은 풍요의 금속을 측정 픽셀 당 1 ~ 2 초의 체류 시간과 단계 검사를 사용합니다. </li><li> 빔라인 특정 소프트웨어로 스캔을 프로그래밍합니다. 래스터 스캔 이미지를 획득. 각 요소에 대해 특징적인 피크 에너지를 식별하는 소프트웨어와 데이터를 분석하는 빔라인 협력자 함께 작업. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

X 선 형광 이미징은 지구과학, 재료 과학, 화학 생물학 26-34 등 많은 분야에서 유용하다. 싱크로트론 X- 레이의 발전, 그리고 그들의 초점은 매우 강도 높은 빔을 생산. 집중 X 선은 현재 이용 가능한 실리콘 드리프트 검출기 기술로 측정 할 수있다 신호를 생성하는 현재 존재하는 세포에서 내인성 금속을 자극하기에 충분한 광선. 그리고 셀 내에서 금속의 화학 생물학을 연구하는 것은이 분?...

형광 이미징은 정체성과 샘플에 존재하는 원소의 양을 모두 허용 X 선은 공간적으로 해결한다. 입사 X 선은, 주목 무거운 요소의 결합 에너지 전자보다 크도록 선택된 에너지, 핵 (1)에 내측 쉘 전자의 결합 에너지를 극복. 이 전자 껍질에 &#39;구멍&#39;을 만듭니다. 높은 에너지의 전자가이 구멍으로 아래로 떨어질 때, 형광 X 선 파장이 그 궤도의 에너지 분리에 의존 방출된다. 오비탈의 에너지 간격은 주어진 요소의 특징이기 때문에, X 선 형광 발광 소자는 파장에 의존하는 특성을 갖는다. 그것은 본 요소의 식별을 허용 특성이 파장에서 발광된다. 형광 강도의 보정은 본 소자의 정량을 허용한다. X 선 형광 microscopY (XFM)는 부분적으로 같은 봄-8 일본, 유럽 방사선 싱크로 시설 프랑스 (ESRF) 및 고급 광자 소스 (의 것과 매우 화려한 X 선 싱크로트론 소스의 개발, 점점 더 활용되고있다 미국 2 APS). 이 소스는 매우 높은 강도의 X 선 빔을 제공한다. 동시에, 이러한 존 플레이트 기술과 같은 X 선 광학 개선은 다소 비효율적 3이라도 서브 마이크론 이러한 스폿 빔의 포커싱을 허용했다. 매우 고강도 빔, 현재 이용 가능한 기술을 검출기로 측정 할 수있는 세포에서 내인성 금속을 자극하기에 충분하다 집중 될 수 광의 심지어 비교적 소량 생산 신호. 따라서, 셀에서 금속의 화학 생물학을 연구하는 것은이 기술 4-10 최근 개발 많은 이용한다 특히 하나의 애플리케이션이다. 앱 동안 고려해야 할 많은 중요한 요소가 있습니다XFM을 누워 배양 된 포유 동물 세포 또는 다른 생물학적 시료의 원소 분포와 정량화를 조사합니다. 첫째, 샘플은 의미있는 것으로 측정 위해서는, 모두 구조적 및 원소 조성에 대하여, 그대로 유지되어야한다. 그것이 집광 X 선 빔에 의해 야기 될 수 방사선 손상에 강건한되도록 둘째, 표본은 어떠한 방법으로 보존되어야한다. 시료가 한 번에 이러한 기준을 모두 만족시킬 수있는 한 가지 방법은 급속 유리체, 비결정질 얼음 11,12으로 고정된다는 것이다. 급속 동결은 종종 플 런지 동결 또는 높은 압력이 13 ~ 16 동결 등 다양한 냉동 보존 기술을 통해 달성된다. 그것은 일반적으로 냉동 보존이 가능한 원시 상태에 가까운 생물학적 샘플에서 전체 세포의 구조와 화학 성분을 보존하는 것이 허용됩니다. 세포 및 조직 내로의 고정 제 느리고 침투로 인한 선택적 한편 화학 고정, w로서엘 막 투과성과 같은 이후의 변화는 다양한 세포 이온 특히 CL, 칼슘과 K로 확산 이온 따라서 17 ~ 19 차선의 이러한 요소의 조사를 렌더링, 침출 손실 또는 이전 할을 허용 할 수있다. 특히 부착 포유 동물 세포의 일반적인 화학 고정, 이상 극저온 고정의 분명한 이점에도 불구하고, 동결 보존은 다양한 한계 20-23있다. 가장 눈에 띄는 사람은 없습니다 모든 연구소가 냉동 보존 장비에 쉽게 접근 할 수 있다는 것입니다. 심지어 현재 대부분의 고압 냉장고 또는 냉동고는 지금까지 세포가 배양되는 곳에서 할 수있다 냉동 시설의 부분 집합에 의해 비용과 소유 뛰어 들다. 냉동 보존의 장점은 셀에 배치 여행 스트레스의 단점과 교환 될 수 있습니다. 동결 반드시 X 선 형광 분석을위한 샘플을 보존하는 방식으로 가장 엄격한 동안 따라서, 확실히 모든 상황에서 모든 연구에 가장 접근 아니다;않으며 항상 필수적인 - 관심 금속 단단히 고정 가능한 거대 분자에 결합하고, 샘플을 이미지화 된 해상도가 건조시 발생할 수있는 초 미세의 손상보다 큰 경우. 주의 사항 24 염두에, 화학 고정 및 건조는 적절한 선택이 될 수 있습니다. 성공적인 X-ray 형광 이미징 실험에서 다른 요소는 적절한 분석을 포함한다. X 선 형광 촬상 근본적 공간 해상도를 제공하기 위해 래스터 주사와 함께 X-ray 형광 발광 스펙트럼이다. 수집 된 X 선 형광 방출 스펙트럼은 발광 피크, 배경, 및 입사 빔의 탄성 및 비탄성 산란 피크를 겹치는 조합을 함유한다. 이러한 기여 디 컨벌루션 및 발광 피크 피팅 가능 소프트웨어는이 필드 (25)에 중요한 발달이었다. 또한, 개발 및 상업적인 DIST재료 수량 형광 강도 상대적인 보정하는 공지 된 조성물의 박막 표준 ribution도 매우 중요했다. 이 프로토콜은 화학적 고정 및 공기 건조 부착 세포의 제조에 대한 설명을 제공한다. 이 과정에서 중요한 단계는 종종 성공에 특정 패션 키에 부드러운 세정을 잘 준수하지 않는 실리콘 질화물 윈도우에있는 세포의 성장이다.

<table><tbody><tr><td>Silicon nitride windows</td><td>Silson Ltd/J B J Business Park/Northampton Rd, Northampton NN7 3DW, United Kingdom</td><td>SiRN-5.0-200-2.0-200. Order by size. Membrane size: 1.5 mm x 1.5 mm. Thickness: 200&amp;nbsp;nm. Frame size: 5&amp;nbsp;mm x 5 mm. Frame thickness: 200 &amp;micro;m.</td><td>Alternate source: SPI Supplies / Structure Probe, Inc. West Chester, PA.</td></tr><tr><td>Reverse tweezers</td><td>Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td><td>78520-5X</td><td>EMS 5X, NC &amp;ndash; Ultra Fine Tweezers</td></tr><tr><td>Rubber grid mat</td><td>Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td><td>71170</td><td>Round Grid Mat</td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td><td>338826</td><td>trace metals grade concentrated acetic acid</td></tr><tr><td>PIPES buffer</td><td>Sigma-Aldrich, 3050 Spruce St., St. Louis, MO 63103, Tel: 800-325-3010, Fax: 800-325-5052</td><td>P6757</td><td>solid PIPES buffer</td></tr><tr><td>Formaldehyde stock solution</td><td>Electron Microscopy Sciences, P.O. Box 550, 1560 Industry Road, Hatfield, PA 19440, Tel: 215-412-8400, Toll Free: 800-523-5874, Fax: 215-412-8450</td><td>RT 17113</td><td>10 x 10 ml ampules of 20% aqueous paraformaldehyde</td></tr></tbody></table>

preparing adherent cells for x-ray fluorescence imaging by chemical fixation

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over large or small sample areas. It has been applied in many areas of science, including materials science, geoscience, studying works of cultural heritage, and in chemical biology. In the case of chemical biology, for example, visualizing the metal distributions within cells allows us to study both naturally-occurring metal ions in the cells, as well as exogenously-introduced metals such as drugs and nanoparticles. Due to the fully hydrated nature of nearly all biological samples, cryo-fixation followed by imaging under cryogenic temperature represents the ideal imaging modality currently available. However, under the circumstances that such a combination is not easily accessible or practical, aldehyde based chemical fixation remains useful and sometimes inevitable. This article describes in as much detail as possible in the preparation of adherent mammalian cells by chemical fixation for X-ray fluorescent imaging.

생물학적 시료에 대한 정보를 제공하는 X 선 형광 영상의 능력은 이들 샘플들은 실험의 시간 규모에서 방사선 손상에 견고 이러한 방식으로 제조되는 달려 있으며, 아직 그들의 화학적 및 구조적 특징은 잘 아르 보존. 정착은 셀의 이러한 측면을 (도 1)를 보존 나타내는 - 전술 한 바와 같이 제조 및 묘화 된 시료의 결과를보고에서는, 본 소자의 변동이 있음을 볼 수있다. <p class="jove_...

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Preparing Adherent Cells for X-ray Fluorescence Imaging by Chemical Fixation

Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays.

화학 고정하여 X-ray 형광 이미징 부착 세포를 준비

X-ray fluorescence imaging allows us to non-destructively measure the spatial distribution and concentration of multiple elements simultaneously over ...

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Research

JoVE Journal

Chemistry

9.3K 조회수.  Argonne National Laboratory. Here, we present a protocol on how to determine the quantity and distribution of metals in a sample using synchrotron X-ray fluorescence. We focus on adherent cells, and describe the chemical fixation method to prepare this sample. We then describe how to mount and image the sample using synchrotron X-rays. 

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In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. They offer new possibilities for the characterization of living systems and are particularly appropriate for detecting, localizing and quantifying the presence of metal oxide nanoparticles both in biological specimens and the environment. Indeed, these techniques all meet relevant requirements in terms of (i) sensitivity (from 1 up to 10 &#181;g.g-1 of dry mass), (ii) micrometer range spatial resolution, and (iii) multi-element detection. Given these characteristics, microbeam chemical element imaging can powerfully complement routine imaging techniques such as optical and fluorescence microscopy. This protocol describes how to perform a nuclear microprobe analysis on cultured cells (U2OS) exposed to titanium dioxide nanoparticles. Cells must grow on and be exposed directly in a specially designed sample holder used on the optical microscope and in the nuclear microprobe analysis stages. Plunge-freeze cryogenic fixation of the samples preserves both the cellular organization and the chemical element distribution. Simultaneous nuclear microprobe analysis (scanning transmission ion microscopy, Rutherford backscattering spectrometry and particle induced X-ray emission) performed on the sample provides information about the cellular density, the local distribution of the chemical elements, as well as the cellular content of nanoparticles. There is a growing need for such analytical tools within biology, especially in the emerging context of Nanotoxicology and Nanomedicine for which our comprehension of the interactions between nanoparticles and biological samples must be deepened. In particular, as nuclear microprobe analysis does not require nanoparticles to be labelled, nanoparticle abundances are quantifiable down to the individual cell level in a cell population, independently of their surface state.

In Situ Detection and Single Cell Quantification of Metal Oxide Nanoparticles Using Nuclear Microprobe Analysis

We describe a procedure for the detection of chemical elements present in situ in human cells as well as their in vitro quantification. The method is well-suited to any cell type and is particularly useful for quantitative chemical analyses in single cells following in vitro metal oxide nanoparticles exposure.

제자리에서 검색 및 핵 현미경 분석을 사용 하 여 금속 산화물 나노 입자의 단일 셀 정량화

Micro-analytical techniques based on chemical element imaging enable the localization and quantification of chemical composition at the cellular level. ...

연구

화학

Processing Embryo, Eggshell, and Fungal Culture for Scanning Electron Microscopy

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, methods involved in processing different biological samples involve unique practices. All conventional practices described in the literature for processing samples still find useful applications, but subtle changes in the sample preparation can alter image quality, as well as, introduce artifacts. Hence, using a unique sample preparation technique specific to the type of tissue analyzed is required to obtain a good quality image with ultrastructural resolution. The focus of this study is to provide the optimal sample preparation protocols for imaging embryos, rigid eggshells, and fungal cultures using SEM. The following optimizations were recommended to yield good results for the three different delicate biological samples studied. Use of milder fixatives like 4% paraformaldehyde or 3% glutaraldehyde followed by dehydration with ethanol series is mandatory. Fungal mycelium on agar blocks obtained by slide cultures yields a better ultrastructural integrity compared to cultures taken directly from agar plates. Chemical drying of embryos with HMDS provides drying without introducing surface tension artifacts compared to critical point drying. HMDS prevents cracking caused by shrinkage as samples are less brittle during drying. However, for fungal culture, critical point drying provides acceptable image quality compared to chemical drying. Eggshells can be imaged with no special preparation steps except for thorough washing and air drying prior to mounting. Preparation methodologies were standardized based on acceptable image quality obtained with each trial.&#160;

Here, we present detailed processing protocols for imaging delicate tissue samples using scanning electron microscopy (SEM). Three different processing methods, namely, hexamethyl disilazana (HMDS) chemical drying, simple air drying, and critical point drying are described for preparing rigid eggshells, embryos at early developmental stages, and fungal cultures respectively.

전자 현미경 검사법을 검사하기위한 배아, 달걀 껍질 및 곰팡이 배양 처리

Although scanning electron microscopy (SEM) is being widely used for the ultra-structural analysis of various biological and non-biological samples, ...

환경과학

Cell Culture on Silicon Nitride Membranes and Cryopreparation for Synchrotron X-ray Fluorescence Nano-analysis

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions and their disturbed homeostasis is involved in various diseases. State-of-the-art synchrotron X-ray fluorescence nanoprobes provide the required sensitivity and spatial resolution to elucidate the two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) distribution and concentration of metals inside entire cells at the organelle level. This opens new exciting scientific fields of investigation on the role of metals in the physiopathology of the cell. The cellular preparation is a key and often complex procedure, particularly for basic analysis. Although X-ray fluorescence techniques are now widespread and various preparation methods have been used, very few studies have investigated the preservation of the elemental content of cells at best, and no stepwise detailed protocol for the cryopreparation of adherent cells for X-ray fluorescence nanoprobes has been released so far. This is a description of a protocol that provides the stepwise cellular preparation for fast cryofixation to enable synchrotron X-ray fluorescence nano-analysis of cells in a frozen hydrated state when a cryogenic environment and transfer is available. In case nano-analysis has to be performed at room temperature, an additional procedure for freeze-drying the cryofixed adherent cellular preparation is provided. The proposed protocols have been successfully used in previous works, most recently in studying the 2D and 3D intracellular distribution of an organometallic compound in breast cancer cells.

Presented here is a protocol for cell culture on silicon nitride membranes and plunge-freezing prior to X-ray fluorescence imaging with a synchrotron cryogenic X-ray nanoprobe. When only room temperature nano-analysis is provided, the frozen samples can be further freeze-dried. These are critical steps to obtain information on the intracellular elemental composition.

싱크로트론 X선 형광 나노 분석을 위한 실리콘 질화물 멤브레인의 세포 배양 및 저온 준비

Very little is known about the distribution of metal ions at the subcellular level. However, those chemical elements have essential regulatory functions ...

생화학

Simple Polyacrylamide-based Multiwell Stiffness Assay for the Study of Stiffness-dependent Cell Responses

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a matrix that is elastic and much softer (0.1 &#8211; 100 kPa). Since such stiffness mismatch greatly affects cell responses, there is a strong interest in developing hydrogel materials that span a wide range of stiffness to serve as cell substrates. Polyacrylamide gels, which are inexpensive and cover the stiffness range of all soft tissues in the body, are the hydrogel of choice for many research groups. However, polyacrylamide gel preparation is lengthy, tedious, and only suitable for small batches. Here, we describe an assay which by utilizing a permanent flexible plastic film as a structural support for the gels, enables the preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format. The technique is faster, more efficient, and less costly than current methods and permits the preparation of gels of custom sizes not otherwise available. As it doesn&#8217;t require any specialized equipment, the method could be easily adopted by any research laboratory and would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

Here, a method that enables quick, efficient, and inexpensive preparation of polyacrylamide gels in a multiwell plate format is described. The method does not require any specialized equipment and could be easily adopted by any research laboratory. It would be particularly useful in research focused on understanding stiffness-dependent cell responses.

간단한 폴리 아크릴 아미드 기반 강성 의존 세포 반응의 연구를위한 멀티 웰 강성 분석

Currently, most of the in vitro cell research is performed on rigid tissue culture polystyrene (~1 GPa), while most cells in the body are attached to a ...

생체공학

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

회전 디스크-총 내부 반사 형광 현미경 검사 법 고급 시각화에 의해 세포 접착 형성

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Bioorthogonal Chemical Imaging of Cell Metabolism Regulated by Aromatic Amino Acids

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, an abundant supply of AAAs is important for cancer cells to maintain their rapid growth and division. With this, there is a rising demand for a highly specific, noninvasive imaging approach with minimal sample preparation to directly visualize how cells harness AAAs for their metabolism in situ. Here, we develop an optical imaging platform that combines deuterium oxide (D2O) probing with stimulated Raman scattering (DO-SRS) and integrates DO-SRS with two-photon excitation fluorescence (2PEF) into a single microscope to directly visualize the metabolic activities of HeLa cells under AAA regulation. Collectively, the DO-SRS platform provides high spatial resolution and specificity of newly synthesized proteins and lipids in single HeLa cell units. In addition, the 2PEF modality can detect autofluorescence signals of nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and Flavin in a label-free manner. The imaging system described here is compatible with both in vitro and in vivo models, which is flexible for various experiments. The general workflow of this protocol includes cell culture, culture media preparation, cell synchronization, cell fixation, and sample imaging with DO-SRS and 2PEF modalities.

We present a protocol to directly visualize metabolic activities in cells regulated by amino acids using deuterium-oxide (heavy water D2O) probed stimulated Raman scattering (DO-SRS) microscopy, which is integrated with two-photon excitation fluorescence microscopy (2PEF).

방향족 아미노산에 의해 조절되는 세포 대사의 생체 직교 화학 이미징

Essential aromatic amino acids (AAAs) are building blocks for synthesizing new biomasses in cells and sustaining normal biological functions. For example, ...

Visualization of Endoplasmic Reticulum Subdomains in Cultured Cells

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and functions despite the intense interorganelle molecular traffic. The techniques described in this paper are powerful means of studying protein and lipid mobility and trafficking in vivo and in their physiological environment. Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) and fluorescence loss in photobleaching (FLIP) are widely used live-cell imaging techniques for studying intracellular trafficking through the exo-endocytic pathway, the continuity between organelles or subcompartments, the formation of protein complexes, and protein localization in lipid microdomains, all of which can be observed under physiological and pathological conditions. The limitations of these approaches are mainly due to the use of fluorescent fusion proteins, and their potential drawbacks include artifactual over-expression in cells and the possibility of differences in the folding and localization of tagged and native proteins. Finally, as the limit of resolution of optical microscopy (about 200 nm) does not allow investigation of the fine structure of the ER or the specific subcompartments that can originate in cells under stress (i.e. hypoxia, drug administration, the over-expression of transmembrane ER resident proteins) or under pathological conditions, we combine live-cell imaging of cultured transfected cells with ultrastructural analyses based on transmission electron microscopy.

We describe the imaging approaches we use to investigate the distribution and mobility of the transfected fluorescent proteins resident in the endoplasmic reticulum (ER) by means of the confocal imaging of living cells. We also ultrastructurally analyze the effect of their expression on the architecture of this subcellular compartment.

배양 된 세포의 소포체 하위 도메인의 시각화

The lipids and proteins in eukaryotic cells are continuously exchanged between cell compartments, although these retain their distinctive composition and ...

생물학

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, offering an unprecedented three-dimensional view of tissue microanatomy. While SBF-SEM has seen an exponential increase in use in recent years, technical aspects such as proper tissue preparation and imaging parameters are paramount for the success of this imaging modality. This imaging system benefits from the automated nature of the device, allowing one to leave the microscope unattended during the imaging process, with the automated collection of hundreds of images possible in a single day. However, without appropriate tissue preparation cellular ultrastructure can be altered in such a way that incorrect or misleading conclusions might be drawn. Additionally, images are generated by scanning the block-face of a resin-embedded biological sample and this often presents challenges and considerations that must be addressed. The accumulation of electrons within the block during imaging, known as "tissue charging," can lead to a loss of contrast and an inability to appreciate cellular structure. Moreover, while increasing electron beam intensity/voltage or decreasing beam-scanning speed can increase image resolution, this can also have the unfortunate side effect of damaging the resin block and distorting subsequent images in the imaging series. Here we present a routine protocol for the preparation of biological tissue samples that preserves cellular ultrastructure and diminishes tissue charging. We also provide imaging considerations for the rapid acquisition of high-quality serial-images with minimal damage to the tissue block.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

This protocol outlines a routine method for using serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM), a powerful 3D imaging technique. Successful application of SBF-SEM hinges on proper fixation and tissue staining techniques, as well as careful consideration of imaging settings. This protocol contains practical considerations for the entirety of this process.

생물학적 조직 샘플의 직렬 블록-얼굴 스캐닝 전자 현미경 검사(SBF-SEM)

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

A 3D Cartographic Description of the Cell by Cryo Soft X-ray Tomography

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these techniques, cryo soft X-ray tomography (SXT) allows imaging whole cryo-preserved cells in the water window X-ray energy range (284-543 eV), in which carbon structures have intrinsically higher absorption than water, allowing the 3D reconstruction of the linear absorption coefficient of the material contained in each voxel. Quantitative structural information at the level of whole cells up to 10 &#181;m thick is then achievable this way, with high throughput and spatial resolution down to 25-30 nm half-pitch. Cryo-SXT has proven itself relevant to current biomedical research, providing 3D information on cellular infection processes (virus, bacteria, or parasites), morphological changes due to diseases (such as recessive genetic diseases) and helping us understand drug action at the cellular level, or locating specific structures in the 3D cellular environment. In addition, by taking advantage of the tunable wavelength at synchrotron facilities, spectro-microscopy or its 3D counterpart, spectro-tomography, can also be used to image and quantify specific elements in the cell, such as calcium in biomineralization processes. Cryo-SXT provides complementary information to other biological imaging techniques such as electron microscopy, X-ray fluorescence or visible light fluorescence, and is generally used as a partner method for 2D or 3D correlative imaging at cryogenic conditions in order to link function, location, and morphology.

Here, a protocol describing the sample preparation and data collection steps required in cryo soft X-ray tomography (SXT) to image the ultrastructure of whole cryo-preserved cells at a resolution of 25 nm half pitch, is presented.

Cryo Soft X선 단층 촬영에 의한 세포의 3D Cartographic 설명

Imaging techniques are fundamental in order to understand cell organization and machinery in biological research and the related fields. Among these ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, frozen-hydrated state. However, cryo-ET requires that samples are thin enough to not scatter or block the incident electron beam. For thick cellular samples, this can be achieved by cryo-focused ion beam (FIB) milling. This protocol describes how to target specific cellular sites during FIB milling using a 3D-correlative approach, which combines three-dimensional fluorescence microscopy data with information from the FIB-scanning electron microscope. Using this technique, rare cellular events and structures can be targeted with high accuracy and visualized at molecular resolution using cryo-transmission electron microscopy (cryo-TEM).

Here, we present a pipeline for 3D-correlative focused ion beam milling on guiding the preparation of cellular samples for cryo-electron tomography. The 3D position of fluorescently tagged proteins of interest is first determined by cryo-fluorescence microscopy, and then targeted for milling. The protocol is suitable for mammalian, yeast, and bacterial cells.

고분해능 극저온 전자 단층촬영을 위한 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling을 이용한 시료 전처리

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...