우리는이 기술의 개발 과정에서 자신의 귀중한 조언과 지원, 비교 의학, 사원, 텍사스의 스콧 &amp; 화이트 병원 부서의 직원과 수의사 감사합니다. 이 작품은 재생 의학 프로그램 자금 연구소, 스콧 &amp; 화이트 RGP 보조금 # 90172, NIH 2P40RR017447-07 및 NIH R01AR066033-01 (NIAMS)에 의해 부분적으로 투자되었다. 우리는 원고를 교정에 대한 박사 수잔 Zeitouni 감사합니다.

참고 :이 프로토콜은 잭슨 연구소에서 획득 한 여성 누드 (민 / J) 마우스 (1,825 G, 6 주)을 위해 설계되었습니다. 쥐의 변종은 해부학과 성장 속도면에서 다소 차이가 있기 때문에, 우리는 핀의 제조 라이브 주제에 주입하기 전에 수신자의 변형, 성별과 연령에 최적화하는 것이 바람직합니다. 균주 신중 일치하는 경우, 핀 및 골수 공동 사이의 억지 끼워 맞춤은 높은 재현성이다. 주택, 다이어트 및 일반 축산 절차는이 프로토콜의 범위를 벗어나 있지만, 모든 마우스는 기관 동물 관리 및 설정 실험실 동물의 관리 및 사용 (제 8 판), 제도적 정책의 가이드에 따라 보관 하였다 사용위원회 (IACUC)와 스콧 화이트 병원에서 비교 의학 교실 (DCM). 핀 1. 제작 <imgALT = &quot;그림 2&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 52368 / 52368fig2highres.jpg&quot;/&gt; 그림 2 : 핀 조립체. (A) 어셈블리의 여러 단계에서 수술 스틸 튜브와 5mm 두께의 gelfoam을 시트에서 4mm 직경의 실린더 컷의 사진. (B) 조립 핀 (위) 연마 후를, gelfoam을 실린더는 강 위에 위치, 트리밍 칼라 (중간), 건조 코팅 gelfoam을 멸균 핀 결과 멸균. 이는 손상 부위에서 세포 부착을 향상시키고 치유 (아래). (C) 수질 핀 장착 절제된 대퇴골의 방향을 유지한다. (D) 다양한 두께의 핀 조립체의 실시 예 및이 방법의 유연성을 보여주는 길이. 근위 및 원위 대퇴골의 단부 해면골 뼈 골수 핀의 상호 작용을 도시하는 핀 - 안정화 대퇴 결함 (E) μCT 재구성. <ol><li> 22 G 스테인리스 피하 튜브의 9mm 길이와 회전 공구에 장착 23.8 mm 직경의 유리 섬유 강화 무거운 의무 컷 - 오프 휠을 사용하여 19 G 튜브의 3mm 길이를 잘라. 튜브 (위의 그림 2A를) 고정 작은 뾰족한 펜치를 사용합니다. 적절한 눈 보호를 착용하고주의 회전 도구를 처리합니다. </li><li> 9mm 샤프트의 중간에 시아 노 아크릴 레이트 접착제를 소량 (약 10 μL)을 놓는다. 중앙에까지 9mm의 기둥 위에 3mm 칼라에 합격 균등과 샤프트 사이의 접착제를 배포하는 트위스트. 디지털 캘리퍼스 한 쌍의 치수를 측정하고 그림 1과 비교. 적어도 15 시간 (그림 2A, 센터)에 대해 설정할 수 있습니다. </li><li> 버 과도한 접착제를 제거하기 위해 220 그릿 에머리이 함유 된 디스크를 사용합니다. </li><li> 회전 공구를 사용하여, 연마 디스크 펠트를 사용하여 핀을 연마. </li><li> 탈 이온수로 씻어 COMPRE 건조ssed 공기. </li><li> 칼라에 대해 새로 만든 핀과 푸시의 샤프트를 통해 19 G 피하 무딘 바늘을 배치하여 테스트의 무결성. 칼라 무게 약 25g 저항 할 수 있는지 확인합니다. </li><li> 멸균 여과 인산염 완충 생리 식염수 (그림 2B, 상단)에있는 핀을 씻어. 핀의 축이 절단 된 뼈 (그림 2C)의 가장자리로 칼라 플러시 대퇴 골수 구멍에 꼭 맞는지 확인합니다. 연구와 수신자 (그림 2D)의 특정 목적을위한 프로토 타입 다양한 구성. 고정을 극대화하고 억지 끼워 맞춤 (그림 2E)을 개선하기 위해 핀의 끝이 골간의 소주 뼈에 침투 있는지 확인합니다. 참고 :이 맞는 라이브 마우스 (예를 들어 그림 2C)에 주입하기 전에 뼈 표본에서 테스트하는 것이 좋습니다. </li><li> 실린더를 잘라 4 mm 직경의 펀치 생검 커터를 사용하여수술 젤라틴 스폰지 5mm 두께의 시트에서. 3mm 길이 실린더를 잘라 내고 구멍 (아래 그림 2A를) 생성하는 실린더의 길이를 따라 20 G 피하 주사 바늘을 ​​통과하기 위해 메스를 사용합니다. 참고 : 우리의 결함 부위에서 젤라틴 또는 콜라겐 지지체의 위치가 셀 보유를 개선하고 뼈의 축선을 따라 종 방향의 성장을 유도하는 것을 발견 하였다. </li><li> 핀에 젤라틴 폼 실린더에 합격하여 15 psi에서 120 ° C에서 건조주기에 칼라 (그림 2B, 센터) 및 오토 클레이브와 맞춰집니다. 젤라틴 폼은 건조 (아래 그림 2B) 색상으로 어두워집니다. </li></ol> 2. 수술 기법 참고 : 다음 절차는 실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서 (제 8 판)에 의해 설정된 모든 지침을 관찰 기록됩니다. 모든 추가 정책을 준수하십시오로컬 IACUC에 의해 설정하고 다음 섹션을 진행하기 전에 장소에 (또는 동급) IACUC 승인 한 동물 사용 프로토콜을 확인합니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig3highres.jpg" /> 그림 3 : 수술 도구. (A) 외과 키트. 마이크로 드릴 (1)에있어서, 바퀴를 절단 (2) 흡수성 봉합사 (3), 외주 봉합사 (4), 메스 블레이드 (5), 메스 핸들 (6), 호에 싸서 멸균 수질 핀 (7)에 수질 깊이 게이지 만든 형태 피하 튜브 (8), 미세 코 집게 (9), 쥐 치아 포셉 (10), 무딘 리밍 바늘 (11), 바늘 드라이버 (12), 작은 지혈제 (13), 미세 가위 (14), 골막 엘리베이터 (15), 수정 컨 셉 (16) (B). 마우스에 대한 컨 스타일의 뼈 그립을 생산하는 데 필요한 수정. <ol><li> 를 통해 트래픽 수술 룸이나 깨끗한 실험실 폐쇄 문 및 더를 선택합니다. 적절한 작업 SURFAC을 소독임상 등급 급 기반의 살균제 청소기와 전자. </li><li> 일회용 멸균 장갑과 가운을 입고 있지만, 멸균 된 천으로 커튼과 소독 작업 표면에 약 60 X 90cm 2의 무균 영역을 설정합니다. 참고 : 조수가 외부 포장을 제거하고 필드를 설정하는 연구자에 멸균 자료를 제시해야하는 것이 좋습니다. </li><li> 드레이프에 따뜻한 물을 재 순환 장치에 장착 살균 가열 패드를 놓고 멸균 일회용 커튼 커버. 작동 온도 비드 살균기 따뜻한 (250-265 ° C가,이 30 분까지 소요). </li><li> 무균 영역에서 모든 구성 요소에 편리하게 액세스를 제공하기 위해 수술 키트 (그림 3A)를 배열합니다. 또한, 멸균 거즈 (2 × 2 인치 2), 멸균 면봉, 멸균 식염수 및 클로르헥시딘 / 이소 프로필 알코올 수술 살균제 어플리케이터 (V / w 0.9 %)를 포함하는 멸균 스틸 그릇 (500 ml)에 제공한다. </li><li> 작은 조립수의학 지침과 사용자 설명서에 따라 유도 챔버와 코 콘 어셈블리 멸균 필드 옆에 동물 마취 장치. 가스 공급 및 이소 플루 란, USP로 임상 수준의 산소를 사용합니다. </li></ol><img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig4highres.jpg" /> 그림 4 : 수술. (AC) 접근 및 대퇴골의 노출. (DE) 상승 및 인하. (FK) 리밍 및 수질 운하의 크기. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig5highres.jpg" /> 그림 5 : 수술. 핀 (AB) 설치. (CD) 폐쇄. (E) 수술 후 올바른 위치에 핀 24 시간의 전형적인 이미지. <ol start="6"><li> 마취 시스템 및 Se 유도 챔버에 놓고 마우스t O 2 분 -1 및 2 L 3 % 이소 플루 란 농도 출력 (V / V). <ol><li> 마우스가 1 분 이내에 의식이 있는지 확인; 4 %로 농도를 상승 (v / v)로 필요한 경우. 아래에 위치 가열 패드 무균 영역에 마우스, 장소를 제거하고 코 콘을 적용합니다. 전송 제도적 정책에 따라 적절한 수술 비행기 콘에 흐름, 2.5 %로 이소 플루 란을 줄이고, 추가로 20 초 동안 기다린 테스트. 일반적으로, 부드럽게 압착 뒷다리 반사의 부족은 적절한 마취를 결정하기에 적합합니다. </li><li> 전체 과정에서 의식을 잃은 동안 산소의 적절한 수준을 보장하기 위해 강력한 규칙적인 호흡과 사지와 입 지역의 분홍색 착색 보조 모니터를 가지고있다. 수의학 지침과 제도적 정책 필요에 따라 마취를 조정합니다. 멸균 된 인공 눈물 윤활유 연고 (15 % (v / v)의 미네랄 오일, 83 %를 적용 (v / v)의 어눈에 ITE 바셀린). </li></ol></li><li> 새로운 일회용 드레이프를 위로 향하게 뒷다리 하나의면에 마우스를 켭니다. 필요한 경우, 전기 면도기 나 제모 크림으로 털을 제거합니다. 멸균 식염수 사이트를 닦은 초과 모피와 함께 추가 드레이프를 제거합니다. 모든 부분하지만 전체 뒷다리 (그림 4A)를 포함하지만, 착색과 호흡을 모니터링하는 얼굴과 발보기를 유지하기 위해 마우스를 통해 새로운 유창 드레이프를 놓습니다. </li><li> 대퇴골 근위부와 원위부 끝을 찾아 종축 (그림 4B)을 따라 5-10mm의 피부를 절개. 이두근 대퇴골과 광근 lateralis를 통해 대퇴골에 측면 접근 방식을 노출, # 15 메스 근막으로부터 피부 층을 분리합니다. 모두 근육의 격막 (이것은 근육의 분홍색 착색에 흰색 조직의 라인) 만나는 곳 찾습니다. 메스로 조심스럽게 intermuscular 경계까지 함께 해부대퇴골 (그림 4B)을 볼 수 있습니다. </li><li> 전체 골간 (그림 4C)을 노출되도록 단단한 골막 엘리베이터 절개를 개발한다. 내측 (그림 4D)의 후방 신경 혈관 다발을 보존하기 위해주의하면서 더 대퇴골의 중앙 2/3 노출 엘리베이터를 사용합니다. 부드럽게 멸균 Q - 팁 또는 이에 상응하는 부드러운 메스와 뼈의 오프 조직, 건조를 긁어. </li><li> 멸균 메스 또는 마커 캘리퍼스 필요한 경우와 표시가있는 대퇴골의 중심을 찾은 후 중심에서 근위 및 원위 1.5 mm를 표시합니다. 조심스럽게 뼈에 과도한 압력을 방지하기 위해 이전에 컨 스타일에서 유행 미세 코 집게의 쌍을 사용하여 대퇴골을 파악. 참고 : 수정에 대한 정확한 치수는 그림 (b)에 제공된다. 그것은 필요 압력을 깨뜨릴 수 없어 뼈를 보장하기 위해 사용하기 전에 안락사 표본에 집게를 테스트하는 것이 좋습니다절단 동안 고정 용 D. </li><li> 미세 다이아몬드 그릿 코팅 절단 휠 (8 mm 직경 X 0.1 mm 폭)가 장착 된 미세 드릴을 사용하여 (그림 4E) 아래 조직을 보호 할 수있는 엘리베이터가 첫 번째 컷을합니다. 단단히 3mm 세그먼트를 제거, 두 번째 컷을하기 위해선, 골간의 말단을 누른 상태에서 45 °로 절단 된 대퇴골을 제기. 참고 : 얼굴 보호는이 단계에서 권장합니다. </li><li> 집게로 고정 뼈, 조심스럽게 무딘 23 G 피하 주사 바늘로 양쪽 끝의 수질 충치를 리머. 19 G 튜브에 넣고 22 G 튜브의 길이로 만들어진 미리 만들어진 깊이 게이지를 사용하여 (그림 3a는, 내가 8 TEM), 리머 수질 캐비티의 깊이를 평가하고 3mm인지 확인합니다 (그림 4 층-K) . 수질 공동 22 G 깊이 게이지 저항 경우, 무딘 22 G 피하 주사 바늘 다시 리머. </li><li> 조심스럽게 다음 근위부 말단 수질 C로 수질 핀을 삽입avities 안정적인 3mm 간격 (그림 5A를, B) 원래 길이에서 다시 대퇴골을 가져오고 설정합니다. 필요한 경우, 대퇴골의 피질골과로드의 양호한 끼워 맞춤을 달성하기 위해 수동 응력의 소량을 적용한다. 핀이 양쪽의 수질 충치에 꼭 맞는 컷 뼈의 가장자리가 칼라가 일치하는지 확인합니다. 간극이있는 경우, 22 G 무딘 바늘을 다시 한번 리밍. </li><li> 핀에 근육과 주변 조직의 위치를 조정하고 연속 흡수 5-0 봉합 (그림 5C)를 닫습니다. 수술 접착제 (그림 5D)와 5-7 광장 매듭 나일론 5-0 봉합과 인감 닫기 피부 절개. </li></ol> 3. 수술 후 절차 <ol><li> 피부 절개를 닫은 후, 마취을 인출하지만, O 2 마우스가 움직이기 시작까지 유동 할 수있게 유지; 이 미만 1 분 소요됩니다. 마우스의 5 분 후 움직이지 남아있는 경우O 2 관리, 동물의 개입에 대한 제도적 정책을 참조하십시오. </li><li> 마우스가 움직이기 시작하면, 바람직하게는 부드럽게 건조 멸균 침구 함유 케이지로 전송. <ol><li> 각 장에 이글루 형 둥지를 놓고 마우스 움직임을 감소, 그것으로 후퇴 할 것이다. 마우스가 뒷다리 이동성을 의식 회복 후 5 ~ 10 분을 복구 있는지 확인합니다. </li><li> 기관의 정책에 따라 매일 수술 후 모니터링을 수행합니다. 첫 번째 5~7일을 위해 새장 바닥에 젤라틴 수분과 음식을 제공하고 제도적으로 승인 된 정책에 따라 통증과 수술 후 모니터링을 관리 할 수​​ 있습니다. 참고 : 우리는 관리 0.05-0.1 mg을 kg -1 회 처음 3 일 후 식염수를 피하 0.25 ㎖를,과 부 프레 노르 핀 (24) 마우스는 정상 유틸리티를 회복하지 않는 경우. </li></ol></li><li> 회복 후 24 시간 후, 운데 살아있는 동물 X 선 촬영을 수행R 마취 핀 배치 (그림 4E)을 시각화합니다. 핀이 탈구되면, 즉시 수정 수술을 고려한다. </li><li> 7 일 후 수술에서, 제도적 축산 정책에 따라 그룹으로 마취와 집에서 봉합사를 제거합니다. </li><li> 2~5주 후, 인도적으로 미국 수의학 협회에 따라 동물을 안락사 (25)에 대한 방법을 승인 안락사. 참고 : 시중에서 판매하는 바르비 투르 산염-조합 안락사 칵테일의 복강 내 주사가 효과적이고 인도적인, 그러나 안락사에 지역 기관 정책을 준수해야합니다. </li><li> 조심스럽게 근위 대퇴골 내측에서 골반을 노출하여 뒷다리를 멀리 해부하다. 메스와 비구 (엉덩이 소켓)에서 대퇴 골두를 분리하면서 조심스럽게 다리의 측면에서 안쪽으로 관절을 누릅니다. 해제, 날카로운 메스 또는 마이크로 가위로 근육과 피부에 남아있는 컷전체 다리는 골반을 형성한다. rongeurs이나 무거운 가위의 날카로운 쌍으로, 낮은 뒷다리 (경골 / 비골) 무릎 관절 아래 약 5mm를 잘라. 주 : 모든 시료 분석 이전에 동일한 방식으로 저장하는 것이 좋습니다. </li><li> 피부를 제거하지만, 자리에 근육을 둡니다. 1개월까지 이전 영상에 10 mM의 CaCl2를 보충 인산염 완충 생리 식염수에 저장 한 다음 일주 10 mM의 염화칼슘이 정착 보충 10 % 포르말린에 조직을 수정합니다. 4 ° C에서 고정 및 저장을 수행합니다. 또한, 즉시 고정하지 않고 표본을 검사합니다. </li></ol> 표본 4. 분석 참고 : 뼈의 치유는이 프로토콜의 범위를 벗어나는 방법의 다양한에 의해 평가 될 수있다. 다음은 우리가 성공적으로 견본 microCT (μCT) 화상 카메라를 사용하여 고용 한 방법이다. 그것은 다음과 같은 매개 변수가 아칸소 것이 좋습니다전자는 프로젝트의 특정 요구에 최적화 된, 처음에 테스트. <ol><li> 악기 챔버 내의 플라스틱 밀봉 막과 수직 위치를 박층에서 시편 감싸. 대퇴골 전체 스캔하는 동안 샘플 단계에 수직 있는지 확인합니다. 다음 매개 변수에 대한 검사를 설정하고, 전압 = 29 kV로, 현재 = 661 μA, 전력 = 19 W, 이미지 픽셀 크기 (μm의) = 21.00; 360도 회전 = 예; 프레임 평균 =에 (5); 에 회전 단계 (DEG) = 1.00, 랜덤 이동 =. 스캔 당 하나의 대상 폴더 (예를 들어 그림 6A)에 JPEG 파일로 이미지를 저장합니다. 참고 : 스캔은 57 분에 완료해야합니다. </li><li> 다음과 같은 파라미터에 기초하여 축 이미지를 생성하기 위해 재구성 소프트웨어를 사용할 수; 스무딩 = (4), 오정렬 보정 =에, 링 이슈 감소 = (5), 빔 경화 보정 (40 %)에, CS 회전 (DEG) = 0.00. 2,000-15,000 하운 스 필드 단위로 출력을 설정합니다. JPEG 파일로 이미지를 저장스캔 당 하나의 대상 폴더에. </li><li> 축 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여, 제 근위 및 원위의 원래 에지 결함을 설정하여 관심 영역 (ROI)의 영역을 정의한다. 만 칼라를 포함 섹션을 선택하여이를 얻을 수 있습니다. 칼라는 수질 핀보다 두꺼운 때문에,이 부분은 ​​쉽게 (왼쪽 그림 6B) 정의된다. (오른쪽 그림 6B) (100 μm의 이익률) 주위 배제 영역을 그리기 및 투자 수익 (ROI)에서 섹션의 각 영역을 전송하여 계산에서 칼라를 제외합니다. 주 : 이러한 새로운 뼈의 부피 (도 6C, D) 등의 관성, 3D 재구성 및 계산 극 모멘트 용이 소프트웨어를 사용하여 달성 될 수있다. </li></ol>

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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+closed+femur+fracture+model+in+mice.">Characterization of a closed femur fracture model in mice.</a> J Orthop Trauma. 18, 687-695 (2004).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rodent+animal+models+of+delayed+bone+healing+and+non-union+formation:+a+comprehensive+review.">Rodent animal models of delayed bone healing and non-union formation: a comprehensive review.</a> Eur Cell Mater. 26, 1-12 (2013).</li><li>Garcia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+reliable+non-union+model+in+mice.">Development of a reliable non-union model in mice.</a> J Surg Res. 147, 84-91 (2008).</li><li>Flecknell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+relief+of+pain+in+laboratory+animals.">The relief of pain in laboratory animals.</a> Lab Anim. 18, 147-160 (1984).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Guidelines on the Euthanasia of Animals. , (2013).</li><li>Neill, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Micro-computed+tomography+assessment+of+the+progression+of+fracture+healing+in+mice.">Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice.</a> Bone. 50, 1357-1367 (2012).</li><li>Bagi, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+micro-CT+to+evaluate+cortical+bone+geometry+and+strength+in+nude+rats:+correlation+with+mechanical+testing,+pQCT+and+DXA.">The use of micro-CT to evaluate cortical bone geometry and strength in nude rats: correlation with mechanical testing, pQCT and DXA.</a> Bone. 38, 136-144 (2006).</li><li>Hadjiargyrou, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+profiling+of+bone+regeneration.+Insight+into+the+molecular+complexity+of+wound+repair.">Transcriptional profiling of bone regeneration. Insight into the molecular complexity of wound repair.</a> J Biol Chem. 277, 30177-30182 (2002).</li><li>Clough, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+regeneration+with+osteogenically+enhanced+mesenchymal+stem+cells+and+their+extracellular+matrix+proteins.">Bone regeneration with osteogenically enhanced mesenchymal stem cells and their extracellular matrix proteins.</a> J Bone Miner Res. , (2014).</li><li>Lu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+basis+for+age-related+changes+in+fracture+repair.">Cellular basis for age-related changes in fracture repair.</a> J Orthop Res. 23, 1300-1307 (2005).</li><li>Jepsen, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+variation+in+the+patterns+of+skeletal+progenitor+cell+differentiation+and+progression+during+endochondral+bone+formation+affects+the+rate+of+fracture+healing.">Genetic variation in the patterns of skeletal progenitor cell differentiation and progression during endochondral bone formation affects the rate of fracture healing.</a> J Bone Miner Res. 23, 1204-1216 (2008).</li><li>Thayer, T. C., Wilson, S. B., Mathews, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+nonobese+diabetic+mice+to+understand+human+type+1+diabetes.">Use of nonobese diabetic mice to understand human type 1 diabetes.</a> Endocrinol Metab Clin North Am. 39, 541-561 (2010).</li><li>Jee, W. S., Yao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overview:+animal+models+of+osteopenia+and+osteoporosis.">Overview: animal models of osteopenia and osteoporosis.</a> J Musculoskelet Neuronal Interact. 1, 193-207 (2001).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

여기서, 우리는 표준 실험실 및 수의 장비를 이용하여 쥐 대퇴골의 임계 크기 핀 - 안정화 된 결함을 생성하는 간단한 방법을 설명한다. 핀과 수술 자체의 조립은 연습이 필요하지만, 잘 잘 훈련 된 생물 의학 연구 과학자 또는 수의사의 기능에 있습니다. 핀은 외고정 또는 연동 나사를 사용 더 복잡한 방법보다 절차가 기술적으로 가능하고, 추가로 고정하지 않고 뼈 속질에 ?...

그것은 치료 골절 환자의 경우 수술, 50 만 절차 골 이식 2의 사용을 포함한다. 미국 인구의 절반이 65 일의 나이 골절이 발생할 것으로 추정되며,이 숫자는 점점 고령화 3 증가 할 것으로 예상된다 . 뼈가 완전히 흉터없이 치유 능력을 갖는 몇몇 기관 중 하나이지만 프로세스 3,4-을하지 아니한 경우, 인스턴스가있다. 상황과 치료의 품질에 따라 긴 뼈 골절의 2-30% 비 노조 3,5의 결과로 실패합니다. 정의, 가관절, 크기의 중요한 또는 비 노조 뼈 부상에 대한 몇 가지 논쟁이 남아있는 동안 일반적으로 피사체 (6)의 자연 수명 기간 동안 치유되지 않는 상처를 의미한다. 실험 목적을 위해,이 기간은 평균 크기의 뼈 상해 완전히 치유에 필요한 평균 시간으로 단축된다. 비 노조 뼈의 병변은 NUM 발생erous 이유,하지만 주요 요인으로 인한 질병 또는 7 세에 비판적 크기의 차이, 감염, 가난한 혈관 신생, 흡연, 또는 억제 osteoregenerative 용량의 결과로 극단적 인 외상을 포함한다. 비 조합이 성공적으로 처리 된 경우에도, 그 손상의 유형 및 사용 방법 (8)에 따라, 프로 시저 당 60,000 달러를 초과하는 비용이있다. 적당한 경우, 자가골 이식술가 사용된다. 이 전략은 부상의 사이트에 공여 부위와 이식에서 뼈의 회복을 포함한다. 이 방법은 매우 효과적이지만, 가능한 도너 - 유도 된 뼈의 용적에 제한이 있으며 절차는 많은 환자에서 지속적인 통증 9,10 결과 추가적인 수술을 포함한다. 또한,자가 골 이식술의 효능, 환자의 건강 의존한다. 합성 물질 또는 처리 사체 뼈로 만든 뼈 대체는 11-13 풍부하게 사용할 수 있습니다,하지만 그들은 하불량한 숙주 세포 접착 성이 감소 osteoconductivity 및 면역 거부 (14)에 대한 전위를 포함 상당한 제한을했습니다. 안전하고 효과적이고 널리 사용되어 골 재생 기술이 시급히 요구된다. 뼈 재생 전략을 개선하기 위해 우리의 능력을 시험 동물에 심각한 뼈 외상을 모방 할 수있는 능력에 결정적으로 의존하지만, 큰 뼈 병변의 생성 및 안정화 기술적 도전이다. 대부분의 경우, 심각한 긴 뼈 외상은 자연적으로 치유되지 않습니다 결함을 구축하여 실험적으로 모방한다. 그것은 15 종에 따라 다를 수 있지만, 이는 뼈의 단면 (16)의 1.5 배보다 큰 직경 뼈 세그먼트의 완전한 제거에 의해 달성된다. 뼈 골절 후 연부의 적절한 배향을 유지하고 이동을 허용하기 위해 금속 임플란트로 안정화된다. 때문에 작은 크기와의 취약성에긴 뼈, 마우스 등 병변의 설립은 대부분의 연구 그룹의 기능을 능가한다. 따라서, 긴 골 결손 모델 쥐와 큰 동물에 국한되어있다. 그럼에도 불구하고, 마우스들은 인간 유전자 변형 세포와 조직을 거부하지 않기 때문에 면역 타협 한 균주로 육종 할 수 있다는 점에서 상당한 이점을 연구 수득. 인간 세포 기반 응용 프로그램의 면역 손상 쥐들이 생리 학적으로 집에 쉽게, 잘 특성화 때문에 작업하기 매력, 비용 대비 효과, 쉽게 조직 학적, 방사선 학적 및 분석. 가장 중요한 면역 손상 마우스는 인간을 포함한 다른 종의 세포를 거부하지 않는다는 것입니다. 그들의 작은 크기도 세포 또는 응용 프로그램 정형 외과에서 실험 비계의 볼륨의 아주 작은 숫자의 테스트를 허용합니다. 몇몇 뮤린 모델은 정형 뼈 안정성 17,18 다양한 정도의 여유도보고되었다. 그 정기적 복용연골 치유가 19을보고 하였지만 이러한 외고정 고정판과 같은 매우 높은 안정성 수준을 초래할 MS 주로 intramembranous 골화 치유. 대조적으로, 이러한 비 고정 또는 부분적 수질 고정 핀을 이용하는 것과 같은 일부 마이크로 및 / 또는 매크로 움직임을 허용 자들은 일반적으로 (20, 21)의 연골 내 골화 우세 치료한다. 지연 유합 또는 긴 뼈의 불유합의 결함으로 인해 필요한 안정화의 추가 수준에 마우스를 달성하는 것이 특히 어렵다. 그러나 접근 방법은 연동 손톱 수질 핀, 잠금 판과 외고정 (22)를 포함하여,보고되었다. 이러한 시스템은 일반적으로 잘 작동하지만 그들의 복잡한 디자인들이 설치가 기술적으로 어려울 수 있습니다 주어. 예를 들어, 가르시아 등. (23)는 마우스에서 사용하기위한 우아한 연동 핀 시스템을 고안 있지만 절차는 두 개의 분리 된 부위에서 절개를 포함s와 대퇴골의 광범위한 수정은 핀을 수용 할 수 있습니다. 이러한 절차는 해부 현미경 하에서 수행 하였다. 여기서, 우리는 3mm 골 결손의 폐쇄를 방지하고 또한 결함의 원래 가장자리를 묘사하기위한 중앙 칼라와 간단한 대퇴 골수의 핀을 설명합니다. 핀 자체가 뼈에 고정되어 있지 않은 동안, 충분한 간섭 골수 공동 결과 핀 직경 리머의 정확한 크기는 비틀림 운동 (도 1)을 최소화한다. 근친 연령, 성별 및 유사한 변형 마우스의 신중한 선택으로, 방사선 학적 결과는 용이하게 평가할 수있다 재현성 비후성 비 uniondefect 22이다. 또한 관심의 영역을 재현성 드 노보 골 형성 및 histomorphological 파라미터 측정 용 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (μCT) 이후에 정의 될 수있다. 핀은 쉽게 사용할 수있는 도구를 사용하여 우리의 실험실에서 프로토 타입했다.<img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52368/52368fig1highres.jpg" /> 그림 1 : 실험 원리 분절 결함 모델의 도식 요약.. 9-10mm 쥐의 대퇴골의 중심 3mm 세그먼트 (왼쪽) 수술로 절제한다. 3mm 길이, 19 게이지 수술 스틸 튜브는 정확한 센터 (오른쪽)에 길이 9mm, 22 G 스테인리스 스틸 관을 통해 전달 및 접착제로 고정되어 있습니다. 얻어진 핀 뼈 3mm 세그먼트 교체 19 G 칼라 (이하, 센터)과 대퇴골 근위부와 원위부 나머지 부분 운하 수질에 장착되어있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="799">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:235px;">Name of Equipment/Material*</td>
			<td style="width:207px;">Company</td>
			<td style="width:180px;">Catalog or model</td>
			<td style="width:179px;">Notes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pin Assembly</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dremel rotary tool</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>8220</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heavy duty cut off wheel</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical tubing 19G</td>
			<td>Small Parts (Amazon)</td>
			<td>B000FMZ8LY</td>
			<td>OD 1.07mm, ID 0.889mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical tubing 21G</td>
			<td>Small Parts (Amazon)</td>
			<td>B000FMZ8YQ</td>
			<td>OD 0.82mm, ID 0.635mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical tubing 22G</td>
			<td>Small Parts (Amazon)</td>
			<td>B000FMYLZS</td>
			<td>OD 0.719mm, ID 0.502mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical tubing 23G</td>
			<td>Small Parts (Amazon)</td>
			<td>B000FN0SY0</td>
			<td>OD 0.643mm, ID 0.444mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cyanoacrylate adhesive</td>
			<td>Loctite</td>
			<td>1365882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Emery disc</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>413</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rubber polishing point</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Felt polishing disc</td>
			<td>Dremel</td>
			<td>414</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gelatin sponge</td>
			<td>Surgifoam/Ethicon</td>
			<td>1974</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Punch biopsy cutter</td>
			<td>Miltex</td>
			<td>33-34</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgery/post-operative</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Warm pad and circulator pump</td>
			<td>Stryker/Thermocare</td>
			<td>TP700, TP700C, TPP722</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coverage quaternary spray</td>
			<td>Steris</td>
			<td>1429-77</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bead sterilizer</td>
			<td>Germinator/CellPoint Scentific</td>
			<td>Germinator 500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anesthesia system</td>
			<td>VetEquip Inc</td>
			<td>901806 or 901807/901809</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Isofluorane anesthetic</td>
			<td>VETone/MWI</td>
			<td>501017, 502017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical disinfectant</td>
			<td>Chloraprep/CareFusion</td>
			<td>260449</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Surgical tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>various</td>
			<td>recommend German made</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Face protection</td>
			<td>Splash Shield</td>
			<td>4505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Rechargable high speed drill</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>18000-17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diamond cutting wheel</td>
			<td>Strauss Diaiond</td>
			<td>361.514.080HP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Absorbable sutures&#160;</td>
			<td>Covidien</td>
			<td>UM-213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Outer sutures</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>668G</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vetbond</td>
			<td>3M</td>
			<td>1469SB</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Hydration gel</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>70-01-1082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Diet gel</td>
			<td>Clear H2O</td>
			<td>72-01-1062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Buprenorphine</td>
			<td>Reckitt and Benckser</td>
			<td>12496-0757-01</td>
			<td>controlled substance</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mouse igloos</td>
			<td>Bio Serv</td>
			<td>K3328, 3570,3327</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Euthanasia cocktail</td>
			<td>Euthasol/Virbac</td>
			<td>710101</td>
			<td>controlled substance</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Analysis</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Live animal imager&#160;</td>
			<td>Orthoscan</td>
			<td>FD Pulse</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Micro-CT unit and software</td>
			<td>Bruker</td>
			<td>Skyscan1174</td>
			<td>or equivalent</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sealing film/Parafilm M</td>
			<td>VWR or Fisher</td>
			<td>100501-338, S37441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td colspan="4" height="20" style="height:20px;">*Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a simple critical-sized femoral defect model in mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

마우스는 일반적으로 의식을 회복하고 뒷다리 이동성에게 마취의 철수 후 5 분에서 10 분. 처음 5 일 동안 개별적으로 마우스를 수용하고, 사지의 과​​도한 사용을 방지하기 위해 환경 농축을 소개하는 것이 좋습니다. 이 목적을 위해, 이글루 형 둥지 둥지 건물에 대한 필요성을 절감하고 휴식을 권장합니다. 우리는 또한 케이지의 바닥에 음식과 하이드로 겔의 조항이 핀 변위의 확률을 줄일 수 ?...

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A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

마우스의 간단한 임계 크기의 대퇴 결함 모델

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

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Research

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Medicine

15.0K 조회수.  Texas A&M Health Science Center. Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice. 