현재 프로토콜은 연구원이 siRNA 로드 된 나노 입자를 생성하고 이러한 나노 입자를 적절하게 특성화하여 후속 연구 전에 동물에 대한 투여적합성을 보장하기 때문에 중요합니다. 이러한 접근법의 장점은 siRNA의 생체 이용률을 증가시키고 중하되어 전신 투여에 적합한 나노입자를 생성하는 나노입자를 생산하는 것이다. 이 기술은 siRNA 나노 입자암, 심혈관 질환 및 자가 면역 질환을 포함한 전신 투여가 필요한 무수한 질병을 치료하기 위해 적용될 수 있기 때문에 영향을 미칩니다.
시작하려면 밀리리터당 33.3 밀리그램의 농도로 에탄올에 폴리머를 녹이고 용해를 보장하기 위해 저어줍니다. 그런 다음 파이펫을 사용하여 폴리머 용액을 10 밀리머 구연산 버퍼로 이송하여 밀리리터당 3.33 밀리그램의 농도에 도달합니다. 50 마이크로몰라의 농도를 달성하기 위해 작은 간섭 RNA를 포함하는 튜브에 증류수를 추가합니다.
10의 인산염 비율을 달성하기 위해 위아래로 파이프팅하여 폴리머 및 작은 간섭 RNA 용액을 튜브에 철저히 혼합한다. 튜브를 주변 온도에서 30분 동안 배치합니다. 그런 다음 pH 8에서 1밀리미터 인산염 버퍼1밀리리터를 튜브에 추가하여 밀리리터당 0.28 밀리그램의 농도를 달성하고 튜브를 피펫팅하거나 반전하여 부드럽게 섞습니다.
최종 pH가 중성임을 확인하기 위해, 약 7.2 ~ 7.5, pH 테스트 스트립에 작은 간섭 RNA 나노 입자 용액의 파이펫 10 마이크로리터. 먼저, 밀리리터당 0.28 밀리그램의 농도로 밀리리터당 0.28밀리리터를 정사각형 석영 또는 폴리스티렌 큐벳으로 여과하여 다이나믹 라이트 산란 시료를 준비한다. 그런 다음 제조업체의 사양에 따라 동적 광 산란 장비를 사용하여 크기와 표면 충전 측정을 기록합니다.
전송 전자 현미경을 사용하여 작은 간섭 RNA 나노 입자의 크기 및 형태를 확인하기 위해 먼저 각 TEM 그리드에 밀리리터 당 0.28 밀리그램에서 여과 된 작은 간섭 RNA 나노 입자 용액의 5 마이크로 리터를 추가합니다. 그리드를 주변 온도에 60초 동안 배치합니다. 3초 동안 필터 용지로 블롯 드라이.
다음으로 각 그리드에 3%의 우라일 아세테이트 용액 5개를 추가하고 20초 동안 배양합니다. 블롯은 3초 동안 건조합니다. 그런 다음 전염 전자 현미경 검사법에서 이미징하기 전에 밤새 건조기에 그리드를 놓습니다.
아가로즈 젤 지체를 수행하기 위해 먼저 2 그램의 전기 포망등급 아가로즈 파우더를 100 밀리리터에 1X 트리아세테이트-EDTA 버퍼를 비커에 넣어 2%의 아가로즈 젤을 생산합니다. 아가로즈를 중단하기 위해 저어주세요. 모든 아가로즈가 용해 될 때까지 1 ~ 3 분 동안 가열전자 레인지에 발견 된 비커를 놓습니다.
냉각되면 밀리리터당 10밀리그램의 농도로 에티듐 브로마이드 5마이크로리터를 비커에 넣고 잘 섞어보세요. 그런 다음 아가로즈를 젤 트레이에 붓고 빗을 놓아 우물을 생산합니다. 젤을 30분 동안 건조시키십시오.
조심스럽게 빗을 제거하여 적재 우물을 남기고 1X Tris-acetate-EDTA 버퍼를 젤 트레이에 부어 최대 채우기 라인을 채웁니다. 그런 다음 SDS없이 염색염을 적재하거나 각 작은 간섭 RNA 나노 입자 제형에 대한 파라핀 필름에 대한 두 개의 마이크로 리터 알리쿼트를 다른 질소에서 인산염 비에 배치합니다. 파이펫은 파라핀 필름에 염색을 적재하는 작은 간섭 RNA 나노 입자 용액의 10 마이크로리터를 혼합합니다.
아가로즈 젤 웰에 혼합물을 넣습니다. 전기 전광 시스템을 전원 공급 장치에 연결하고 전압 소스를 100볼트에서 35분 동안 또는 샘플이 젤 길이의 80%를 통과할 때까지 전력 공급 장치에 연결합니다. 트레이에서 UV 트랜실루미나이터로 젤을 옮기고 제조업체의 사양에 따라 UV 트랜실루미나이터에 있는 작은 간섭 RNA 밴드를 시각화한다.
겔 의 바닥에 작은 간섭 RNA 대역의 실종에 기초하여 인산염 비율에 최적의 질소를 결정합니다. 모델 유전자 루시파아제를 노크하기 위해, 10%의 밀도로 DMEM을 가진 96웰 블랙 월판에서 첫 번째 종자 루시파아제를 발현하는 세포는 웰당 2, 000 세포의 밀도로. 세포를 부착할 수 있도록 밤새 인큐베이터에 접시를 넣습니다.
아침에 는 미디어를 제거하고 100 나노 몰라의 최종 작은 간섭 RNA 농도에 대한 전체 혈청 매체로 희석 작은 간섭 RNA 나노 입자의 우물 당 10 마이크로 리터를 추가합니다. 작은 간섭 RNA 나노 입자로 세포를 취급하기 위해 24 시간 동안 인큐베이터에 우물을 반환합니다. 다음 날, 밀리리터 D-루시페린 당 150 마이크로그램을 포함하는 전체 혈청 매체로 미디어를 대체하십시오.
플레이트 판독기에서 발광을 측정하기 전에 실온에서 5분 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 D-luciferin이 없는 신선한 풀 세럼 미디어로 미디어 다과를 두 번 반복한 다음 24시간 동안 인큐베이션을 반복합니다. 미디어를 밀리리터 D-루시페린당 150밀리그램이 함유된 전체 혈청 매체로 교체하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
48시간 시점에서 발광을 측정합니다. 세로 연구의 경우, 생체 안전 캐비닛 외부의 경우 우물 판 위에 뚜껑을 두어 멸균 조건하에서 세포를 유지하고 루시페린 함유 미디어를 신선한 전체 매체로 대체한 후 인큐베이션을 계속하십시오. 동적 광 산란 측정은 작은 간섭 RNA 나노 입자 하나 35 나노 미터의 평균 직경을 가지고 있음을 보여줍니다.
피크 폭이 좁은 단일 피크의 존재는 단모달 분포와 낮은 다각형성을 나타냅니다. TEM 측정은 동적 광 산란으로부터의 크기 측정을 확인하여 작은 간섭 RNA 나노입자의 균일한 집단의 존재를 시사하고 작은 간섭 RNA 나노입자의 구형 형태를 드러냈다. 준비 단계에서 중합체의 너무 높은 농도는 200 나노미터 이상의 바람직하지 않은 직경, 멀티 모달 및 다분산 인구, 그리고 뚜렷한 입자 형태를 형성하지 않는 용액의 골재에서 작은 간섭 RNA 나노 입자 2를 초래했다.
작은 간섭 RNA 나노 입자 하나 와 두 개의 디스플레이 중립 표면 전하 는 거의 제로에 의해 표시 제타 잠재적 인 값을 의미한다. 아가로즈 겔 지체 분석은 중합체에 작은 간섭 RNA의 복합화를 나타내는 젤 바닥에 작은 간섭 RNA 밴드의 실종을 나타낸다. 중합체 복합소형 간섭 RNA는 겔을 통해 마이그레이션할 수 없으며 따라서 하중 우물 근처의 겔 의 상부에 시각화된다.
인산염 에 대한 질소가 증가함에 따라 겔 바닥에 있는 작은 간섭 RNA 대역의 강도감소로 나타난 바와 같이 작은 간섭 RNA 복합체가 증가한다. 생리활성 루시파아제 작은 간섭 RNA 나노입자 1은 스크램블 컨트롤과 비교했을 때 루시파라기 활성을 현저히 감소시켰다. 대조적으로, 루시파라제작은 간섭 RNA 나노입자 2는 생리활성으로 간주되지 않는다.
원하는 물리화학적 특성을 가진 일관된 siRNA 나노 입자를 생성하려면 적절한 농도를 가진 폴리머 솔루션을 사용하고 프로토콜의 각 단계에서 완충액의 pH를 검증해야 합니다. 우리의 연구에서 이러한 방법을 사용하여 우리는 이전에 마약이 없는 암을 일으키는 유전자를 위한 siRNA 나노 입자 기지를 둔 치료를 생성하고 유방암의 전 임상 모형에 있는 이 치료의 효험을 시험할 수 있었습니다.
