우리의 프로토콜은 질병 진행에 관련있는 분자 변경의 확인을 통해 1 차및 전이성 병변 사이 유전 관련성의 포착을 허용합니다. 우리의 방법은 높은 감도와 특이성을 가진 임상 견본에 있는 유전 관련성을 탐구하는 기회를 제공합니다. 이것은 분자 및 조직 병리학 분석의 통합 때문입니다.
암 연구 분야에서 종양 이질성의 평가는 효과적인 항종양 전략을 설계하는 데 가장 중요하며 우리의 방법은 많은 고형 종양 유형에 광범위하게 적용됩니다. 관심 있는 라이브러리를 준비하고 정량화한 후 각 라이브러리를 뉴클레아제 없는 물에 100피코몰라 농도로 희석하고 각 희석 된 라이브러리의 10 마이크로리터를 결합하여 단일 튜브에서 단일 실행을 합니다. 그런 다음 파이펫팅으로 풀로 풀이 된 라이브러리를 혼합합니다.
시퀀싱 실행을 시작하려면 먼저 시퀀싱 시스템에 연결된 컴퓨터에서 토런트 브라우저를 엽니다. 선택한 응용 프로그램에 대한 일반 템플릿을 사용하여 키트 탭에서 이온 양성자 시스템 또는 이온 진 스튜디오 S5 시스템을 선택하여 새 실행을 계획합니다. 칩 유형 드롭다운 메뉴에서 적절한 칩을 선택하고 라이브러리 키트 드롭다운 목록에서 Ion AmpliSeq 2.0 라이브러리 키트를 선택합니다.
템플릿 키트에 대한 Ion Chef 버튼을 선택하고 템플릿 키트 드롭다운 목록에서 적절한 Chef 키트를 선택합니다. 시퀀싱 키트 드롭다운 메뉴에서 적절한 시퀀싱 키트를 선택하고 바코드 세트 드롭다운 목록에서 Ion Express를 선택합니다. 플러그인 탭에서 커버리지 분석 플러그인을 선택합니다.
계획 탭에서 참조 라이브러리 드롭다운 목록에서 GRCH37HG19 게놈을 선택합니다. 대상 지역 드롭다운 목록에서 시퀀스할 적절한 패널을 선택합니다. 그런 다음 시퀀시할 바코드 수를 설정하고 각 라이브러리에 대한 바코드 이름과 샘플 이름을 설정합니다.
풀이 된 라이브러리 희석의 경우, 핵이 없는 물로 스톡 라이브러리를 25 피코몰라 농도로 희석하여 각 희석 된 라이브러리의 이온 양성자 칩 및 파이펫 50 마이크로리터를 적절한 라이브러리 샘플 튜브의 바닥으로 희석하십시오. 풀링된 희석 라이브러리를 포함하는 샘플 튜브를 라이브러리 준비 시스템에 로드하고 복제 증폭을 시작합니다. 차세대 시퀀싱의 경우 화면 의 지침을 따라 계측기를 초기화합니다.
복제 증폭이 완료되면 Ion Chef 계기문을 열고 칩 로딩 원심분리기의 뚜껑을 열고 라이브러리 준비 시스템에서 두 개의 칩을 제거합니다. 칩을 별도의 칩 저장 용기에 넣고 칩 중 하나를 계측기의 칩 컴파트먼트에 로드합니다. 그런 다음 칩 구획 뚜껑을 닫고 시퀀싱을 시작합니다.
돌연변이 분석을 위해 커버리지 분석 플러그인을 열고 커버리지 분석 출력을 사용하여 커버리지 및 균일성을 확인합니다. 토런트 변형 발신자 플러그인을 사용하여 세균 선 또는 체세포 워크플로우를 적절하게 선택하는 변형 호출을 수행합니다. 그런 다음 필터링된 변형 호출 형식 파일을 다운로드하고 NCBI RefSeq 데이터베이스의 변형 효과 예측 변수 소프트웨어를 사용하여 변형에 대해 알테를 지정합니다.
복사 수 변동을 추정하려면 이온 리포터 업로더 플러그인을 사용하여 이온 리포터 소프트웨어에 시퀀싱 데이터를 로드하고 포괄적인 암 패널 종양 정상 쌍 워크플로우를 사용하여 데이터를 분석합니다. 소프트웨어가 할당한 점수에 따라 돌연변이 및 복사 수 변형을 수동으로 필터링하고 통합 유전체학 뷰어를 시각적으로 변형을 확인합니다. 그런 다음 체형 호출을 생성할 수 있는 특이한 읽기에 대한 정렬을 시각적으로 검사하고 기준선의 정규화된 커버리지에 대해 주어진 유전자에 걸쳐 모든 앰플리턴에 대한 정규화된 커버리지를 검사하여 카피 수 변이를 확인합니다.
각각의 경우에 대해, 돌연변이는 정상 조직 또는 혈액 또는 1차 종양 또는 전이의 시퀀싱으로부터 호출된다. 세균 선으로 플래그를 표시하고 또한 세균 선 DNA의 시퀀싱 데이터에서 분명 호출을 폐기. 클론 또는 설립자로 지정된 환자의 모든 병변 사이에서 공유되는 돌연변이를 플래그.
그런 다음 특정 환자의 병변을 전부는 아니지만 일부에서 검출되는 돌연변이를 서브클론 또는 진행자로 플래그를 지정합니다. 본 대표적인 실험에서, 409개의 암 관련 유전자의 코딩 서열을 표적으로 하는 5개의 고체 의사도파필라신생물의 다중 병변 염기서열분석은 8개의 유전자에 있는 총 27개의 체질 돌연변이를 확인하였다. 돌연변이는 주어진 환자의 일부 그러나 전부병변에서 검출될 때 주어진 환자 및 진행자 또는 과감의 모든 병변 사이에서 공유될 때 창립자 또는 클로날로 정의되었습니다.
일관되게, 베타 카테닌및 KMD6A를 위한 면역히스토케미칼 염색은 해당 유전자의 돌연변이를 가진 케이스의 다양한 병변 사이에서 균질하였다. 돌연변이 된 표본에서 KMD6A에 대한 적당한 염색은 유전 적 변경이 단백질의 발현보다는 기능을 변경하기 위하여 확률이 높다는 것을 건의합니다. KMD6A 췌장 종양에서 기능의 손실은 저산소증 마커 GLUT-1의 최대 조절과 연관된다.
그리고 이에 따라, GLUT-1은 KMD6A 돌연변이를 베어링하는 경우에 과도하게 발현되었다. BAP1 및 TP53에 대한 면역 조직 화학은 그 유전자에 있는 돌연변이가 청가이었다는 것을 확인했습니다. 변경된 유전자의 위치, 근접 성 및 복사 수 상태를 나타내는 대표적인 사례의 가상 karyotype에서, 시퀀싱 데이터를 이용한 카피 수 변이 분석은 분석된 모든 표본에서 변화를 드러냈다.
그리고 점 돌연변이와는 달리, 카피 수 변이 변경의 대부분은 서브클론이었다. 돌연변이 및 복사 수 변이의 유효성 검사 및 인덱싱 및 종양 정상 DNA 비교를 사용하여 결과를 무효화할 수 있는 관절상 호출의 생성을 피하는 데 중요합니다. 이 절차는 또한 다른 고형 종양 모형의 병변 사이 돌연변이의 확인을 위한 전체 게놈을 심문하기 위한 전체 게놈 순서연구결과에 적용될 수 있었습니다.
암 연구 분야에서, 이 기술은 개인화되고 효과적인 표적으로 한 치료를 디자인하기 위한 중요한 임상 연루를 가진 질병의 생물학을 이해하기 위한 중요한 공구입니다.
