항체는 실험실 기술에 일상적으로 사용되며 치료 및 진단 응용 분야는 빠르게 확장되고 있습니다. 빠르고 정확한 항원-항체 결합 특성화는 이러한 응용 분야에서 매우 중요합니다. 질량 광측정은 매우 적은 양의 재료를 사용하여 바인딩 친화성을 신속하게 측정합니다.
라벨이나 고정이 필요하지 않으며 단백질 올리고머화 및 순도에 대한 정보는 동일한 실험에서 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜은 항체를 연구할 뿐만 아니라 50킬로달톤보다 큰 분자 질량을 가진 단백질에 대한 강력한 단백질 단백질 결합을 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 소프트 팁 집게와 세척 병을 사용하여 증류수, 에탄올, 증류수, 이소프로판올 및 증류수로 위에서 아래로 24~ 50mm 커버립을 순차적으로 헹구는 것으로 시작합니다.
마지막 세척 후, 집게에서 오염을 전송하지 않도록 같은 방향으로 깨끗한 질소의 스트림으로 커버립을 건조. 24- 24밀리미터 커버립을 증류수와 에탄올로 헹구고 깨끗한 질소를 건조시합니다. 건조 후 24 mm 24mm 커버슬립을 알루미늄 호일 조각에 놓고 양면 테이프 스트립을 커버슬립에 놓습니다.
그런 다음 24mm에서 24mm 커버슬립을 호일에서 잘라 내고 호일을 24mm 50mm 커버슬립의 작업 측에 부드럽게 누릅니다. 친화성 측정을 위한 항체 항원 시료를 제조하기 위해 0.22 미크론 주사기 필터를 통해 PBS의 적어도 2밀리리터를 걸러내고, 먼지 입자와 골재를 제거하고, 원심분리하여 항체 및 항원주에 관심이 있다. 항체 및 항원 주식의 280 나노미터 UV 흡광도를 측정하여 실제 농도를 결정하고, 시료당 50 마이크로리터의 최종 부피에서 적절한 범위의 항원 농도에서 항체-항원 혼합물의 적정계를 준비한다.
그런 다음 항원-항체 혼합물을 실온에서 약 10분 동안 배양하여 결합 반응이 화학적 평형에 도달할 수 있도록 한다. 질량 광측정에 의한 항체-항원 선호도를 평가하기 위해, 현미경 침지 오일 한 방울을 계측기 목표에 적용하고 현미경의 단계에 유동 챔버를 배치한다. 유량 챔버 채널의 한쪽 끝에 여과된 PBS 10 마이크로리터를 추가합니다.
버퍼는 모세관 동작으로 채널을 입력합니다. 데이터 수집 소프트웨어의 포커스 컨트롤 탭에서 거친 스테이지 이동 버튼을 위아래로 사용하여 초기 조정을 하고 선명도를 클릭하여 선명도 신호 판독을 봅니다. 미세한 위아래로 조정 버튼을 사용하여 선명도 값을 최대화하고 초점 설정 및 잠금 포커스를 클릭하여 포커스 추적 기능을 활성화합니다.
클린 슬라이드의 이미지는 첫 번째 항체 항원 시료의 0.05% Load 20 마이크로리터와 동일한 신호 값을 가져야 하며, 다른 쪽 끝에서 작은 블로팅 용지로 액체를 얼룩져야 합니다. 로드 즉시 레코드를 클릭하여 100초에 해당하는 적절한 수의 데이터를 수집합니다. 데이터 수집 기간이 끝나면 데이터에 대한 파일 이름을 입력하고 확인을 클릭한 다음 샘플을 클릭하여 파일을 저장합니다.
대량 광측정 데이터를 분석하려면 관심 파일을 열고 분석을 클릭합니다. 부하를 클릭하여 교정 기능을 로드하고 파일을 클릭하고 분석된 데이터를 저장하기 위해 결과를 저장합니다. 샘플에서 각 종의 상대적 농도를 얻으려면 장착 된 이벤트를 엽니 다.
csv 파일은 열 M의 데이터를 적절한 플롯 및 분석 소프트웨어로 복사하고 플롯 통계 히스토그램 기능을 사용하여 분자 질량 분포를 플롯합니다. 히스토그램을 두 번 클릭하여 플롯 속성 창을 열고 자동 비닝을 사용하지 않도록 설정하고 2.5킬로달톤의 빈 크기를 선택합니다. 빈 센터를 만들고 데이터를 계산하려면 적용을 클릭하고 이동합니다.
히스토그램에 가우시안 함수에 맞게 하려면 빈 센터를 선택하고 열을 계산하고 분석 피크와 여러 피크 핏 메뉴 함수를 클릭합니다. 두 번 클릭하여 배포 플롯에서 대략적인 피크 위치를 나타내고 NL 맞춤 열기를 클릭합니다. XC 피크 센터에 대한 고정 확인란을 확인하고 자유 항체 및 단일 및 이중 항원 항체 복합체의 예상 분자 질량에 값을 설정합니다.
너비 매개 변수에 대한 공유 옵션을 확인하고 맞춤을 클릭합니다. 가우시안 성분의 장착된 피크 높이 값은 시료의 각 종의 상대적 농도를 나타냅니다. 그런 다음 방정식을 사용하여 피크 높이 값에서 각 종의 농도 분수를 계산합니다.
스프레드시트 프로그램을 사용하여 평형 상수를 계산하려면 해리상수 계산을 엽니다. xlsx 워크 시트. 이 워크시트에서 1~10개의 노란색 강조 표시된 셀 값을 수정하여 평형 상수 계산을 수행할 수 있습니다.
나노몰러 단위로 추정된 해리 상수 값을 세포 B1 및 B2로 입력한다. 예상 해리 상수 값을 알 수 없는 경우 셀 B1 및 B2의 기본 값을 변경하지 않은 상태로 둡니다. 나노몰러 단위로 전체 항체 및 총 항원 농도를 세포 D2 및 E2로 입력하고 세포 F2, G2 및 H2로 각 종에 대한 계산된 분획 값을 입력합니다. 적정에 대한 글로벌 분석을 수행할 때 적절한 데이터 분획 값을 행 2에서 10까지 행에 추가합니다. 솔버 매개 변수 창에서, 가변 셀 박스를 변경하여 설정 된 목표 상자 및 셀 B1에 대한 셀 B15를 선택합니다.
to 옵션에 대한 최소 버튼을 선택하고 구속되지 않은 변수가 음수 가변이 아닌 확인란을 확인한 다음 해결 방법으로 GRG 비선형을 선택하고 해결 방법을 클릭합니다. 가장 적합한 해리 상수 값은 셀 B1 및 B2에 표시됩니다. 그리고 제곱 된 오류의 최종 합계는 셀 B15에 표시됩니다. 본 대표적인 실험에서, 고정된 25나노몰러 농도에서 항인간 혈전 항체를 가진 적정계는 0, 7.5, 15, 30, 60 및 120 나노몰라 인간 알파-트롬빈 농도를 실시하여 항원-항체 혼합물 및 항체 샘플의 분자 질량 분포를 얻기 위해 수행되었다.
가우시안 성분의 피크 높이 파라미터에 가장 잘 맞는 피크 포미터가 정규화되어 종 농도 분획을 얻었다. 농도 분획 값은 항원-항체 결합 친화성을 얻기 위해 전 세계적으로 적합하였다. 실험농도 분획 및 자유항체, 단일 항원 항체 복합체 및 이중 항원 복합체에 대한 전 세계적 적합성 결과를 플롯할 수 있다.
정확한 KD 값을 얻으려면 모든 반응 종을 채우기 위해 단백질 농도를 신중하게 선택해야 합니다. 다양한 항원 농도를 사용하여 적정 계열을 준비하는 것이 좋습니다. 데이터를 피팅한 후 오류 프로젝션 방법을 사용하여 피팅 오류를 얻을 수 있지만 실험을 반복하고 평균 바인딩 선호도 값의 표준 편차를 계산하는 것이 좋습니다.
