현재까지, 다능성 줄기 세포에서 분화된 대뇌 오르간노이드는 토착 인간 뇌 조직에 가장 가까운 시험관 3D 모델이다. 또한 대뇌 오르가노이드는 다양한 중추 신경계 병리학을 모델링하고, 약리활성 물질을 테스트하며, 재생 의학에도 사용하기에도 똑같이 적합합니다. 한편,이 기술은 여전히 개발의 초기 단계에있다.
프로토콜은 골재를 획득하는 방법과 분화와 함께 추가 재배 방법에 따라 두 그룹으로 나눌 수 있다. 첫 번째는 시장 관 또는 플레이트와 같은 특수 저접착 장치에서 셰이커에서 가이너의 후속 성숙을 가진 재배 시간 및 분화 유도제에서 상이한 분화프로토콜 및 구성 방식을 포함한다. 또 다른 그룹은 특수 생물 반응기 사용을 포함한다.
다양한 프로토콜의 분석은 오르가노이드가 순환 영양소 매체와 조건하에서 재배되어야한다는 것을 보여 주었다. 그러나 표준 크기 및 형태와 함께 organoid를 얻기위한 간단하고 저렴한 시스템의 부재는 프로세스를 확장하기 위한 이러한 장치의 개발이 필요합니다. 이 작업에서는 다량의 고품질 오르가노이드를 얻을 수 있도록 간단하고 저렴한 미니 바이오 반응기를 획득하고 테스트하는 방법을 설명합니다.
멸균 15 밀리리터 원심분리기 튜브를 7밀리미터 높이 또는 8밀리미터 높이로 자릅니다. 링을 자동 복제합니다. 처리된 또는 미생물학적 페트리 접시에 대한 낮은 응집을 부스러기로 나누기.
액체 플라스틱을 준비하기 위해 밤새 10 밀리리터의 클로로폼에 약 1 그램의 플라스틱 부스러기를 녹입니다. 멸균 울트라 저접착 6센티미터 페트리 접시의 중앙에 플라스틱 노브를 만드십시오. 두 가지 똑같이 적합한 방법이 있습니다.
첫 번째, 중앙에 플라스틱 링에 오토 클레이브를 넣고 반지의 내부에 액체 플라스틱의 절반 밀리리터를 적용합니다. 두 번째, 어떤 플라스틱 반지없이 페트리 접시의 중심에 액체 플라스틱의 절반 밀리리터를 드롭. 전체 건조가 될 때까지 라미나르 플로우 후드에 2~ 3시간 동안 요리를 열어 둡니다.
만능 줄기 세포를 위한 배지에서 유도된 다능성 줄기 세포를 육성하고, 35mm 페트리 접시에 최대 75 또는 90%의 결합을, 감기 덜베코 변형 이글 배지에 용해된 매트릭스로 미리 코팅된 및 피셔-12 배지. 중간 크기 A 플러스 혈청 교체를 준비합니다. 혈청 교체를 통해 배지에서 1일 동안 유도된 만능 줄기 세포를 육성한다.
다능성 줄기 세포를 위한 배지를 분화의 제로일0에서 혈청 대체 배지로 변경한다. 준비 매체 A.환분2일에 중간 정도의 A로 변경합니다. 중간 크기 A에서 2 주 동안 세포를 재배하고 2 일마다 페트리 요리에서 중간 정도의 상쾌한 매체를 재배하십시오.
14일째에는 각 웰에 약 1, 200 마이크로웰이 들어 있는 특수 24웰 배양판을 사용하여 스페로이드 형성을 시작합니다. 마이크로웰로 24웰 배양판을 준비합니다. 중간 크기의 1 밀리리터 에 추가, 원심분리기는 플레이트 홀더가 장착 된 스윙 버킷 로터에 5 분 동안 1, 300g에서 간단히 합니다.
마이크로웰에 거품이 없다는 현미경의 밑에 통제합니다. 중간 크기의 B.페트리 접시에서 매체를 제거합니다. 세포 분리의 경우 PBS에서 제조된 1.5 밀리리터 EDTA 용액으로 세포를 치료하십시오.
현미경의 밑에 세포 분리를 통제합니다. 세포를 15 밀리리터 튜브로 수확하십시오. 튜브에 5 밀리리터 혼합 덜벡코와 피셔 배지를 세포쪽으로 넣습니다.
원심 분리기 200g에서 5 분 동안. 미디엄 B.의 2 밀리리터에서 상체및 재중단 세포를 제거하여 마이크로웰이 있는 24웰 플레이트의 각 웰에 10억 개의 세포를 함유한 세포 현탁액을 전달한다. 부드럽게 파이펫 셀을 여러 번 위아래로 부드럽게 피펫하고 원심분리기는 1분 동안 100g짧게 100g을 짧게 하여 마이크로웰에서 세포를 포획합니다.
세포가 마이크로웰에서 균등하게 분포되는 현미경의 밑에 통제합니다. 스페로이드의 세포 응집용밤새 플레이트를 배양합니다. 다음날 아침인 15일, 건강하면 투명하고 매끄러운 스페로이드의 품질을 현미경으로 확인합니다.
각 우물에서 15 밀리리터 튜브로 스페로이드를 조심스럽게 수집하고, 스페로이드를 2 분 과 3 분 동안 중력으로 침전한 다음 상체를 제거하십시오. 매트릭스의 스페로이드 2 밀리리터에 추가, 얼음에 해동 및 전 템포. 피펫팅으로 부드럽게 섞고 실온에서 30분 동안 배양합니다.
매트릭스의 과잉을 세척하려면 중간 크기의 B.Pipette의 튜브 8 밀리리터를 부드럽게 추가 한 다음 100g에서 1 분 동안 튜브를 원심 분리합니다. 상부체를 제거합니다. 중간 크기의 B, 파이펫의 튜브 20 밀리리터에 추가한 다음 스페로이드 서스펜션을 미니 바이오 리액터로 분할합니다.
그런 다음 미니 바이오 반응기를 15센티미터 페트리 접시에 넣고 물과 오염의 증발을 방지합니다. 페트리 접시에 미니 바이오 리액터를 궤도 셰이커에 놓습니다. 회전 속도 70, 75rpm에서 오르가노이드를 재배합니다.
16일째에는 중간 C.Transfer 오가노이드를 50밀리리터 튜브로 준비합니다. 5분 동안 바닥에 떨어지게 합니다. 수퍼네티드를 흡습하고 중간 C.의 5 밀리리터를 추가하여 미니 생물 반응기에서 오르가노이드에 다시 참여합니다.
중간 C에서 2 주 동안 스페로이드를 재배하고 2 일마다 배지를 상쾌하게합니다. 이 2 주 동안, 다음 재배를 위해 미니 생물 반응기 당 약 100 스페로이드를 선택합니다. 30일째에, 성숙배지인 중간D로 중간D를 준비한다.
3 주 동안 2 또는 3 일마다 재배 배지를 새로 고칩니다. 그런 다음 F 및 GDNF에 용해된 배지 D를 사용합니다. 중간 A 와 B에서 연속 재배 의 1 개월 후, 크기와 형태에 표준화 된 오르가노이드를 얻을 수 있습니다.
성장함에 따라 매체를 더 자주 변경해야 하며, 일주일에 최대 4회까지 증가합니다. 재배 2 개월 후, 그들은 직경 4 및 5 밀리미터에 도달합니다. 그리고 또 다른 달 후, 5 및 6 밀리미터 와 성장 중지.
그림은 헤마톡신과 에오신으로 그려진 오르가노이드 효소, 명확한 섹션의 모양을 보여줍니다. 1개월 동안의 면역집중화학적 분석은 내부 중앙 부분을 포함한 전구 세포의 SOX2 양성 클러스터의 존재를 나타낸다. 오르가노이드의 말초에서, 글리아 피동산성 단백질, 마이크로투알 관련 단백질 2, 티아진 하이드로라제 양성.
세포는 뉴런의 성숙한 형태에 해당하는 농축된다. 어떤 경우에는 괴사 부위에 흰색 클러스터가 중앙 부분에 형성됩니다. 이는 더 큰 오르가노이드를 얻기 위한 이 프로토콜의 한계를 나타냅니다.
가장 가능성이, 성장의 제한 요소는 영양소와 산소의 확산의 속도. 다양한 미디어 및 세포 유형의 스페로이드및 일부 종류의 오르가노이드에 대한 우리의 시스템을 테스트합니다. 많은 뇌와 망막, 간 암종 세포와 중간 엽 줄기 세포에서 결합 된 오르가노이드, 자본 폭발 중간 엽 줄기 호출및 유도 된 다능성 줄기 세포및 장 오르가노이드에서 분화되는 조혈 줄기 세포에서 결합 된 오르가노이드.
세포의 초기 조성에서 변수였습니까? 분화 인자, 배양 및 중간, 세포외 매트릭스 및 가스 혼합물 조성물, 플랫폼 회전속도 및 기타 파라미터. 다양한 장기 및 조직에서 동일한 모양, 크기 또는 형태학적 모델로 오르가노이드를 얻을 수 있을 것입니다.
이 작업에 제안 된 미니 생물 반응기의 사용.
