We thank Ms. Deborah Postiff and Ms. Jackline Barikdar in the Tissue Procurement Core and Dr. Cindy DeLong in the Pluripotent Stem Cell Core Laboratory at the University of Michigan for her technical assistance. This study was supported by University of Michigan startup funding and grants from the Central Surgical Association, American College of Surgeons, Melanoma Research Alliance, and NIH/NCI (1K08CA197966-01) to F. Ito.

참고 : 환자는 셀위원회가 연구를 승인 줄기 임상 시험 심사위원회와 인간 다 능성에 참여하는 동의를 제공해야합니다. 1. 분리 및 TILS의 문화 <ol><li> 병리 서비스 / 조직 조달 코어에서 병리 조직 학적 진단을 위해 필요하지 않습니다 종양 물질을 얻습니다. 30 ml의 종양 수집 미디어 (표 1)과 50 ml의 튜브에 종양 표본의 20-100g를 놓습니다. </li><li> 고체, 회사, 가위를 사용하여 깨지기 쉬운 및 / 또는 피 묻은 괴사 지역에서 종양 표본의 정상 조직을 해부하다. 괴사 조직을 제거한 후 가능한 한 작게 시편을 말하다하기 위해 가위를 사용합니다. </li><li> 제조자의 지시에 따라 dissociator 종양 분리 키트 (인간)를 사용하여 단일 세포 현탁액 내로 해리 다진 표본. 50 ML 튜브에 설정되어있는 70 μm의 셀 스트레이너와 서스펜션 필터와 함께 스트레이너을 2 회 반복한다RPMI 1640 2 ㎖. </li><li> 5 분 동안 실온에서 200 × g으로 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 T 세포 배지 (표 1) 10ml에 세포를 재현 탁. </li><li> 예컨대 피콜 100 % 구배 용액 10 ㎖의 하부 단계 및 둘 베코 인산염으로 희석하고 75 % 구배 용액 30 ㎖의 중간 단계로 50 ㎖의 튜브 (구배 용액)으로 두 단계 구배 용액을 준비 완충 식염수, 아니 칼슘, 아니 마그네슘 (D-PBS (-)). </li><li> (단계 1.5) 구배 용액에 (단계 140에서) 세포 현탁액 층을 포함한다. 45 분 동안 20 ° C에서 400 XG에 원심 분리기. </li><li> 100 % 구배 용액 및 50 ㎖ 튜브에서 75 % 구배 용액의 계면에서 농축 TILS을 함유하는 층을 수집한다. D-PBS 중 20 ~ 30 ml를 첨가하여 농축 TILS와 용액의 희석 층 (-). </li><li> 5 분 동안 실온에서 200 × g으로 원심 분리기. 뜨는을 취소하고 10 ml의에 TIL 풍부한 부분을 재현 탁T 세포 매체. </li><li> 배양 37 ° C에서 6 웰 플레이트에 2 T 세포 배지 ㎖의 6000 IU / ml의 재조합 인간 (RH) IL-2로한다 (단계 1.8)에서 분획, 5 % CO 2. </li><li> 배양 개시 후 5 일에 절반 미디어를 변경 한 후 2-3 일마다. </li><li> 1의 비율로 세포 분열 2 : 트립신없이 부드럽게 80~90%에 포화 상태에 도달 할 때 우물의 수를 두배로 현탁 한 후. 6000 IU / ml의 신선한 T 세포 매체와 rhIL-2의 절반 량 (1ml)에 추가한다. </li></ol> 마이 토마 이신-C-처리 SNL 피더 셀 플레이트 2. 준비 <ol><li> 80-90% 합류 (3-4 × 106 세포)까지 0.1 % 젤라틴 코팅 10cm 접시에 SNL 피더 세포 배지 (표 1) 10ml에 문화 SNL 피더 세포로 진행한다. </li><li> 직접 SNL 피더 세포 배양 접시에 0.4 ㎎ / ㎖ 마이 토마 이신 C 용액 310 μl를 추가하고 37 ° C 2 시간 15 분, 5 % CO 2 부화. 미디어 a를 대기음ND 5ml를 D-PBS로 두 번 세포를 씻어 (-). </li><li> 0.5 ml의 0.25 % 트립신 / 1mM의 EDTA를 첨가하고 세포를 해리 1 분 동안 실온에서 배양한다. 중화 SNL 피더 세포 미디어 4.5 ML을 추가하고 하나의 현탁액에 세포를 재 - 일시 중지합니다. </li><li> 5 분 동안 200 XG에 15 ML 튜브와 원심 분리기로 세포를 전송합니다. 미디어 대기음 SNL 피더 세포 배지 10ml에 다시 현탁 한 후 혈구 세포 계산. </li><li> 플레이트 1.5 × 10 6 10cm 접시에 SNL 피더 세포의 웰 당 세포와 37 ° C에서 품어, 5 % CO 2. 삼일 이내에 SNL 피더 세포를 사용합니다. </li></ol> 센다이 바이러스를 사용하여 iPSCs의 3 세대 (SEV) 벡터 <ol><li> 수확 TILS 및 플레이트 - 결합 된 마우스 항 - 인간 CD3 (1 μg의 / ㎖) TILS 5 × 105 세포를 활성화하고 수용성 마우스 항 - 인간 CD28 (/ ㎖ 5 μg의) (단계 1.11)에서, rhIL-2 세에서 6 웰 플레이트에서 T 세포 배지 2 ㎖에 (6000 IU / ㎖)7 ° C를 5 일 동안 5 % CO 2. </li><li> 피펫을 사용하여 15 ml의 튜브 (단계 3.1)을 TILS를 수확하고, 혈구와 세포 수를 계산합니다. </li><li> 500 μL의 rhIL-2 1 판 - 결합 된 마우스 항 - 인간 CD3 (1 μg의 / mL)로 TILS의 X 105 세포 및 가용성 마우스 항 - 인간 CD28 (5 μg의 / ㎖) (60 IU / ㎖) 활성화 37 ° C에서 24 웰 플레이트에 웰 당 프로그래밍 미디어 (표 1), 24 시간 동안 5 % CO 2의. SEV 감염에 대한 3 우물을 준비합니다 OCT3 / 4, SOX2, KLF4 및 c-MYC (1도) SEV 감염 (GFP : 녹색 형광 단백질) (1도) 세포 수 (1 웰). </li><li> (단계 3.3에서) 24 시간 후, 혈구와 세포 수를 계산하고 감염의 다양한 (3-20) 다중도 (MOI) 각 바이러스의 양을 결정합니다. -80 ° C 저장 영역에서 센다이 바이러스 벡터 튜브 한 세트를 제거합니다. 수조 (37 ° C)에서 신속하게 SEV 벡터를 해동하고 얼음에 배치합니다. 바이러스의 양 (μL)= MOI (CIU / 셀) 바이러스 / 역가 세포의 X 번호 (CIU / ㎖) × 10-3 (μL / ㎖) </li><li> 활성화 TILS 포함 매체로 10-20 MOI에서 SEV 벡터의 혼합물을 첨가하여 개별적 OCT3 / 4, SOX2, KLF4 및 c-MYC을 수행 네 센다이 바이러스 벡터 튜브의 각각의 계산 된 양을 추가한다. </li><li> 형질 도입 효율을 확인하려면 활성화 TILS의 우물에 SEV-GFP의 계산 된 볼륨을 추가합니다. </li><li> (단계 3.5에서 3.6 단계) 접시를 놓고 24 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2의 인큐베이터에서. 24 시간 후, 형광 현미경 하에서 SEV-GFP 감염 TILS를 사용하여 감염 효율을 추정한다. </li><li> 15 ML 튜브에 (단계 3.5에서) 세포를 수집합니다. 5 분 동안 실온에서 200 × g으로 원심 분리기. </li><li> 상층 액을 제거하고 영장류 ES 세포 매체와 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF 4 NG / mL)로 hESC의 미디어 0.5 ㎖에 펠렛을 재현 탁. </li><li> 접점 10cm의 접시에 현탁액을 전송인 hESC의 배지 10ml에 SNL 피더 세포 미토 마이신 C는 처리. 식민지가 성장 될 때까지 다른 모든 날 hESC의 미디어를 변경합니다. </li><li> 21 일 (18)의 주위에, 클린 벤치에서 10 μl의 팁을 사용하여 현미경으로 식민지 주위 SNL 피더 세포를 제거합니다. </li><li> 10 μl의 팁을 사용하여 콜로니를 긁어 96 웰 조직 배양 플레이트의 웰 당 iPSCs 배지 100 ㎕에 200 ㎕의 팁을 사용하여 전송. 피펫 최대 2-3 시간에 아래로 50 ~ 100 μm의 평균 크기가 작은 덩어리로 식민지를 중단합니다. </li><li> 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF 4 NG / mL)로 iPSCs 매체의 웰 당 2 ㎖ 중의 (단계 2)에서 미토 마이신 C 처리 SNL 피더 세포를 6 웰 조직 배양 플레이트에 작은 덩어리로 이동. 매일 iPSCs 미디어를 변경합니다. </li><li> 모든 5~6일 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제 IV 신선한 마이 토마 이신-C-처리 SNL 피더 세포와 6 잘 조직 배양 플레이트에 iPSCs를 전송합니다. immun 각 클론의 접시 당 2 우물을 준비ostaining. </li><li> 만능 마커 (SSEA3, SSEA4, TRA-1-60, TRA-1-81, 및 OCT3 / 4) (1) 면역 조직 화학 염색을하여 각 클론의 전체 재 프로그래밍을 결정합니다. 참고 : 만능 잠재력의 추가 평가를 위해 완전히 재 프로그래밍 IPSC 라인이 배아 체 형성과 분화 분석 또는 기형 종 형성 분석 (16)에 의해 삼 배엽으로 분화 할 수 있는지 확인합니다. </li><li> 완전히 재 프로그래밍 IPSC 라인은 세포 유전 학적 분석에 의해 정상 핵형을 보여 있는지 확인합니다. </li><li> 기형 종 형성, 미분화 TIL 유래 IPSC DMEM 6-8 주령 암컷 NOD / SCID 마우스의 피하 조직에 10 % FCS를 함유하는 100 ㎕ (1 × 106) 현탁액을 주입. 헤 마톡 실린 및 에오신으로 얼룩 기형 종 섹션. </li></ol> SSEA3, SSEA4, TRA1-60 및 TRA1-81에 대한 iPSCs 4. 면역 형광 염색법 <ol><li> 워시 PBS 1 ㎖와 iPSCs 및 4 % PA 1 mL로 iPSCs 해결10 분 동안 raformaldehyde 솔루션입니다. 4 %의 파라 포름 알데히드 용액을 제거하고 PBS 3 회 1 mL로 iPSCs 씻는다. 참고 :이 독성이 있기 때문에 파라 포름 알데히드를 사용하는 경우주의해야합니다. </li><li> 30 분 동안 버퍼 (표 1)과 차단 iPSCs를 전처리. 한편, PBS 및 트리톤 희석 차 항체 (래트 항 - 인간 SSEA3 마우스 항 - 인간 SSEA4 마우스 항 - 인간 TRA1-60, 마우스 항 인간 TRA1-81) 1시 50분 1.5 % 염소 혈청을 희석 용액 -100 (총 용적 1 ㎖). </li><li> 차단 버퍼 (표 1)를 제거합니다. 희석 차 항체 용액을 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 한편, 이차 항체 (항 - 마우스 IgG를 및 IgM의 또는 항 래트 IgM의) 1시 50분 1.5 % 염소 혈청을 희석 용액. </li><li> 희석 차 항체 용액을 제거하고 5 분 동안 1 ml의 PBS 3 회, 각과 iPSCs를 씻는다. 희석 차 항체 용액을 첨가하고 암실에서 실온에서 45 분 동안 배양한다. </l난&gt; <li> 희석 차 항체 용액을 제거하고 5 분 동안 PBS 3 회 1 ml의 각으로 iPSCs를 씻는다. 면역 형광 현미경으로 iPSCs을 준수하십시오. </li></ol> Oct3에 대한 iPSCs 5. 면역 형광 염색 / 4 <ol><li> 워시 PBS 1 ㎖와 iPSCs 10 분간 4 % 파라 포름 알데히드 용액을 1 mL로 iPSCs 해결. 4 %의 파라 포름 알데히드 용액을 제거하고 PBS 3 회와 iPSCs를 씻는다. </li><li> permeabilization 완충액 (표 1)를 첨가하고, 10 분 동안 실온에서 배양한다. permeabilization 버퍼를 제거하고 버퍼 (표 1) 차단 추가합니다. </li><li> 실온에서 30 분 동안 인큐베이션. 한편, 버퍼를 차단의 기본 항체 (마우스 항 - 인간 Oct3 / 4) 1:50 희석. </li><li> 희석 차 항체 솔루션을 추가하고 밤새 4 ° C에서 품어. </li><li> 희석 차 항체 용액을 제거하고 5 분 동안 PBS 1ml를 3 회 각을 iPSCs를 씻는다. 한편, 디(항 - 마우스 IgG / IgM의 염소) 류트 이차 항체 1 : 100 버퍼를 차단한다. </li><li> 희석 차 항체 용액을 첨가하고 45 분 동안 암실에서 실온에서 배양한다. </li><li> 희석 보조 용액을 제거하고 5 분 동안 PBS 3 회 1 ml의 각으로 iPSCs를 씻는다. 면역 형광 현미경에서 iPSCs을 준수하십시오. </li></ol>

<ol>
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The authors declare that they have no competing financial interests.

여기, 우리는 OCT3 / 4, SOX2, KLF4 및 c-MYC는 네 개의 전사의 SEV 매개 형질 도입에 의해 iPSCs에 흑색 종 TILS를 재 프로그래밍하기위한 프로토콜 요인 보여 주었다. 이 방법은 T 세포를 재 프로그램하는 SEV 시스템을 사용하여, 비 - 통합 방식 (7)의 이점을 제공한다. 이전의 연구는 SEV 리 프로그래밍 시스템은 섬유 모세포뿐만 아니라 말초 혈액 T 세포 7,17뿐만 아니라 재...

전사 인자의 정의 된 설정의 과발현을 통해 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)의 생성을 허용 세포 리 프로그래밍 기술은 세포 기반 치료 1,2- 분야에서 큰 가능성을 보유하고있다. 이러한 iPSCs는 전사와 후생 유전 학적 특징을 나타내는 유사 배아 줄기 세포 (는 ESC) 3-5 자기 갱신과 다 능성에 대한 용량을 가지고있다. 지난 10 년 동안 프로그래밍 기술로 만든 놀라운 진보는 우리가 심지어 T 세포 6-8으로 말기 분화 세포에서 인간 iPSCs를 생성 할 수있다. T 세포 유래 iPSCs는 (TiPSCs)는 TiPSCs 9-11에서 항원 특이 적 T 세포의 재생을 허용하는 원 T 세포와 같은 T 세포 수용체 (TCR) 쇄 유전자의 동일한 재 배열 된 구성을 유지한다. 흑색 침윤 림프구의 약 80 % (TILS)이 환자의 종양 특이 적 종양 관련 항원 A를 인식 얻은차 원래 암세포 (12)에 대한 세포 독성을 유지한다. 특히 TILS에 프로그램 된 세포 사멸 단백질 -1 (PD-1)의 발현은 돌연변이 neoantigen 특정 CD8 + 림프구 (13)을 포함한자가 종양 반응성 레퍼토리를 식별하는 것으로 밝혀졌다. 예비 lymphodepleting 요법 및 인터루킨 -2 (IL-2)의 전신 투여와 함께 전 생체 확장자가 TILS의 입양 전송 환자 (14)의 하위 집합에서 전이성 흑색 종의 실질적인 회귀가 발생할 수 있습니다. 전임상 모델에서 환자의 결과를 유도에도 불구하고, 불량한 주입 된 T 세포의 생존과 면역 억제 경로의 존재는 T 세포 대체 치료 잠재력을 손상시킬 것으로 보인다. 현재 임상 프로토콜은 다수 얻기 위해자가 T 세포의 광범위한 생체 조작을 필요로한다. 이것은 생존율이 불량한 말단 분화 된 T 세포를 감소 prol의 발생을 초래iferative 용량, PD-1 (15)의 높은 수준. 대체 T 세포 요법이 이론적 한계에 대한자가 면역 T 세포의 무제한 소스를 제공 할 수 iPSCs를 사용함으로써 극복 될 수있다. 최근 센다이 바이러스 (SEV) 네 개의 전사 인자 - 매개 전달, OCT3 / 4, SOX2, KLF4 및 c-MYC × 16 PD-1의 높은 발현 수준을 흑색 TILS의 프로그래밍을보고 하였다. 레트로 바이러스 벡터가 재 프로그래밍 유전자를 표현하기 위해 호스트 염색체에 통합을 필요로하지만, SEV 벡터가 아닌 통합하고 결국 세포질에서 제거된다. 효율성을 재 프로그래밍하는 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 벡터에 비해 6-8 SEV 시스템 훨씬 높다. 렌티 바이러스 또는 레트로 바이러스 벡터에 의해 생성 된 일부 IPSC 클론 nonlymphoid 계통 6-8에서 할 수 있지만 또한 SEV 특히, 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)에서의 T 세포를 재 프로그램 할 수있다. 여기, 우리는 세부 사항절차는 인간 흑색 종 TILS의 단리 및 활성화와 SEV 리 프로그래밍 시스템을 사용 TIL 유래 iPSCs의 발생 구현.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="856">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">gentle MACS C Tubes</td>
			<td style="width:287px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:132px;">130-093-237</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">gentle MACS Dissociator</td>
			<td style="width:287px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:132px;">130-093-235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Tumor Dissociation Kit, human</td>
			<td style="width:287px;">Miltenyi Biotec</td>
			<td style="width:132px;">130-095-929</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">RPMI 1640</td>
			<td style="width:287px;">Life technologies</td>
			<td style="width:132px;">11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Falcon 70 um Cell Strainer</td>
			<td style="width:287px;">BD</td>
			<td style="width:132px;">352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">BD Falcon 50ml Conical Cntrifuge tubes</td>
			<td style="width:287px;">BD</td>
			<td style="width:132px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">IMDM</td>
			<td style="width:287px;">Life technologies</td>
			<td style="width:132px;">12440053</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">human AB serum</td>
			<td style="width:287px;">Life technologies</td>
			<td style="width:132px;">34005100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">L-glutamine (200mM)</td>
			<td style="width:287px;">Life technologies</td>
			<td style="width:132px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">2-mercaptoethanol (1000x, 55mM)</td>
			<td style="width:287px;">Life technologies</td>
			<td style="width:132px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Penicillin-Streptomycin&#160;</td>
			<td style="width:287px;">Life technologies</td>
			<td style="width:132px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">gentamicin</td>
			<td style="width:287px;">Life technologies</td>
			<td>15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td style="width:287px;">GE</td>
			<td style="width:132px;">17-1440-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">D-PBS (-)</td>
			<td style="width:287px;">Life technologies</td>
			<td style="width:132px;">14040-133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">recombinant human (rh) IL-2</td>
			<td style="width:287px;">Aldesleukin, Prometheus Laboratories Inc.</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD3</td>
			<td style="width:287px;">BD</td>
			<td style="width:132px;">555329</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Purified NA/LE Mouse Anti-Human CD28</td>
			<td style="width:287px;">BD</td>
			<td style="width:132px;">555725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">X-VIVO 15</td>
			<td style="width:287px;">Lonza</td>
			<td style="width:132px;">04-418Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">FBS</td>
			<td style="width:287px;">Gibco</td>
			<td style="width:132px;">26140-079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">HEPES</td>
			<td style="width:287px;">Life technologies</td>
			<td style="width:132px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">N-Acetylcysteine</td>
			<td style="width:287px;">Cumberland Pharmaceuticals Inc.</td>
			<td style="width:132px;">NDC 66220-207-30</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Falcon Tissue Culture Plates (6-well)</td>
			<td style="width:287px;">Corning</td>
			<td>353046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Falcon Tissue Culture Plates (24-well)</td>
			<td style="width:287px;">Corning</td>
			<td style="width:132px;">353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">Sendai virus vector</td>
			<td style="width:287px;">DNAVEC</td>
			<td style="width:132px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:271px;">SNL feeder cells</td>
			<td style="width:287px;">Cell Biolabs, Inc</td>
			<td style="width:132px;">CBA-316</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">mitomycin C</td>
			<td style="width:287px;">SIGMA</td>
			<td style="width:132px;">M4287</td>
			<td>soluble in water (0.5 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">gelatin</td>
			<td style="width:287px;">SIGMA</td>
			<td style="width:132px;">G1890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Primate ES Cell Medium</td>
			<td style="width:287px;">Reprocell</td>
			<td style="width:132px;">RCHEMD001</td>
			<td>warm in 37 &#8451; water bath before use</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">basic fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td style="width:287px;">Life technologies</td>
			<td style="width:132px;">PHG0264</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ReproStem</td>
			<td style="width:287px;">Reprocell</td>
			<td style="width:132px;">RCHEMD005</td>
			<td>warm in 37 &#8451; water bath before use</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of induced pluripotent stem cells from human melanoma tumor-infiltrating lymphocytes

생체의 입양 전송 전이성 흑색 종 환자의 상당한 부분 집합의 내구성과 완전한 응답을 중재 할 수자가 종양 침윤 림프구 (TILS)을 확장했다. 이 접근법의 주요 장애물 텔로미어 단축에 의한 전사 T 세포의 감소 된 가능성, 그리고 TILS의 제한된 수의 환자로부터 얻은. 그러나, 이들 덜 분화 된 T 세포의 다수 발생하는 문제이다 텔로미어 길이 덜 분화 된 T 세포는 T 세포 대체 요법을위한 이상적인 T 세포의 서브 세트 일 것이다. 대체 T 세포 요법이 제한 이론적하여 유도 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)에 의해 극복 될 수있는 자기 갱신 능성, 길쭉한 텔로미어를 유지 및 면역 요법자가 T 세포의 무제한 소스를 제공한다. 여기서는 TILS로 프로그래밍 인자의 형질 센다이 바이러스 벡터를 사용 iPSCs를 생성하는 프로토콜을 제시한다. 이 프로토콜은 생성완전히 재 프로그래밍, 벡터없는 클론이야. 이러한 TIL 유래 iPSCs는 T 세포 대체 요법에 대한 환자 - 덜 분화 된 종양 특이 적 T 세포를 생성 할 수있을 것이다.

그림 1은 항 CD3 / CD28와 활성화 및 TILS에 OCT3 / 4, KLF4, SOX2 및 c-MYC의 유전자 전달 뒤에 rhIL-2 흑색 종 TILS의 초기 확장을 포함하는 절차의 개요를 보여줍니다 iPSCs의 생성. 일반적으로, rhIL-2 시작과 문화에 TILS는 구체에게 문화의 개시 후 21-28일을 형성한다. 이 시점에서, TILS는 항 CD3 활성화 될 준비가되어 / CD28가. 그림 2A 문화에 TILS은 rhIL-2 21 일에, 활성...

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Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

인간의 흑색 종 종양 침윤 림프구에서 유도 만능 줄기 세포의 생성

Adoptive transfer of ex vivo expanded autologous tumor-infiltrating lymphocytes (TILs) can mediate durable and complete responses in significant subsets ...

generation-induced-pluripotent-stem-cells-from-human-melanoma-tumor

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.7K 조회수.  University of Michigan. The goal of this protocol is to show the protocol for reprogramming melanoma tumor-infiltrating lymphocytes into induced pluripotent stem cells.

비디오: Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Melanoma Tumor-infiltrating Lymphocytes

Generation of Integration-free Human Induced Pluripotent Stem Cells Using Hair-derived Keratinocytes

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using patient-specific hiPSCs allows the study of the underlying mechanism for pathogenesis, also providing a platform for the development of in vitro drug screening and gene therapy to improve treatment options. The promising potential of hiPSCs for regenerative medicine is also evident from the increasing number of publications (>7000) on iPSCs in recent years. Various cell types from distinct lineages have been successfully used for hiPSC generation, including skin fibroblasts, hematopoietic cells and epidermal keratinocytes. While skin biopsies and blood collection are routinely performed in many labs as a source of somatic cells for the generation of hiPSCs, the collection and subsequent derivation of hair keratinocytes are less commonly used. Hair-derived keratinocytes represent a non-invasive approach to obtain cell samples from patients. Here we outline a simple non-invasive method for the derivation of keratinocytes from plucked hair. We also provide instructions for maintenance of keratinocytes and subsequent reprogramming to generate integration-free hiPSC using episomal vectors.

This manuscript provides a step-by-step procedure for the derivation and maintenance of human keratinocytes from plucked hair and subsequent generation of integration-free human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) by episomal vectors.

헤어 유래 각질 세포를 사용하여 통합없는 인간 유도 만능 줄기 세포의 생성

Recent advances in reprogramming allow us to turn somatic cells into human induced pluripotent stem cells (hiPSCs). Disease modeling using ...

연구

발생학

Three-dimensional Quantification of Dendritic Spines from Pyramidal Neurons Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are distributed along the dendrites. Their morphology is largely dependent on neuronal activity, and they are dynamic. Dendritic spines express glutamatergic receptors (AMPA and NMDA receptors) on their surface and at the levels of postsynaptic densities. Each spine allows the neuron to control its state and local activity independently. Spine morphologies have been extensively studied in glutamatergic pyramidal cells of the brain cortex, using both in vivo approaches and neuronal cultures obtained from rodent tissues. Neuropathological conditions can be associated to altered spine induction and maturation, as shown in rodent cultured neurons and one-dimensional quantitative analysis 1. The present study describes a protocol for the 3D quantitative analysis of spine morphologies using human cortical neurons derived from neural stem cells (late cortical progenitors). These cells were initially obtained from induced&#160;pluripotent stem cells. This protocol allows the analysis of spine morphologies at different culture periods, and with possible comparison between induced&#160;pluripotent stem cells obtained from control individuals with those obtained from patients with psychiatric diseases.

Dendritic spines of pyramidal neurons are the sites of most excitatory synapses in mammalian brain cortex. This method describes a 3D quantitative analysis of spine morphologies in human cortical pyramidal glutamatergic neurons derived from induced&#160;pluripotent stem cells.

인간 유도 만능 줄기 세포에서 파생 된 피라미드 뉴런에서 돌기 쪽의 3 차원 정량화

Dendritic spines are small protrusions that correspond to the post-synaptic compartments of excitatory synapses in the central nervous system. They are ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral T Cells Using Sendai Virus in Feeder-free Conditions

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on dermal fibroblasts obtained by invasive biopsy and retroviral genomic insertion of transgenes, there have been many efforts to avoid these disadvantages. Human peripheral T cells are a unique cell source for generating iPSCs. iPSCs derived from T cells contain rearrangements of the T cell receptor (TCR) genes and are a source of antigen-specific T cells. Additionally, T cell receptor rearrangement in the genome has the potential to label individual cell lines and distinguish between transplanted and donor cells. For safe clinical application of iPSCs, it is important to minimize the risk of exposing newly generated iPSCs to harmful agents. Although fetal bovine serum and feeder cells have been essential for pluripotent stem cell culture, it is preferable to remove them from the culture system to reduce the risk of unpredictable pathogenicity. To address this, we have established a protocol for generating iPSCs from human peripheral T cells using Sendai virus to reduce the risk of exposing iPSCs to undefined pathogens. Although handling Sendai virus requires equipment with the appropriate biosafety level, Sendai virus infects activated T cells without genome insertion, yet with high efficiency. In this protocol, we demonstrate the generation of iPSCs from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of activated T cell culture and Sendai virus.

This protocol describes how to generate induced pluripotent stem cells (iPSCs) from human peripheral T cells in feeder-free conditions using a combination of matrigel and Sendai virus vectors containing reprogramming factors.

피더가없는 조건에 센다이 바이러스를 사용하여 인간 말초 T 세포로부터 유도 된 다 능성 줄기 세포의 생성

Recently, iPSCs have attracted attention as a new source of cells for regenerative therapies. Although the initial method for generating iPSCs relied on ...

Induced Pluripotent Stem Cell Generation from Blood Cells Using Sendai Virus and Centrifugation

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent state. Now, reprogramming is done with various types of adult somatic cells: keratinocytes, urine cells, fibroblasts, etc. Early experiments were usually done with dermal fibroblasts. However, this required an invasive surgical procedure to obtain fibroblasts from the patients. Therefore, suspension cells, such as blood and urine cells, were considered ideal for reprogramming because of the convenience of obtaining the primary cells. Here, we report an efficient protocol for iPSC generation from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). By plating the transduced PBMCs serially to a new, matrix-coated plate using centrifugation, this protocol can easily provide iPSC colonies. This method is also applicable to umbilical cord blood mononuclear cells (CBMCs). This study presents a simple and efficient protocol for the reprogramming of PBMCs and CBMCs.

We propose a protocol for reprogramming peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) into induced pluripotent stem cells (iPSCs). By plating the transduced blood cells onto matrix-coated plates with centrifugation, iPSCs are successfully induced from floating cells. This technique suggests a simple and effective reprogramming protocol for cells such as PBMCs and CBMCs.

센다이 바이러스 원심 분리를 이용하여 혈액 세포로부터 유도 만능 줄기 세포의 생성

The recent development of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) proved that mature somatic cells can return to an undifferentiated, pluripotent ...

Generation of Integration-free Induced Pluripotent Stem Cells from Human Peripheral Blood Mononuclear Cells Using Episomal Vectors

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal Vectors (EV) to generate integration-free iPSCs from peripheral blood mononuclear cells (PB MNCs). The episomal vectors used are DNA plasmids incorporated with oriP and EBNA1 elements from the Epstein-Barr (EB) virus, which&#160;allow for replication and long-term retainment of plasmids in mammalian cells, respectively. With further optimization, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood. Two critical factors for achieving high reprogramming efficiencies&#160;are: 1) the use of a 2A &#34;self-cleavage&#34; peptide to link OCT4 and SOX2, thus achieving equimolar expression of the two factors; 2) the use of two vectors to express MYC and KLF4 individually. Here we describe a step-by-step protocol for generating integration-free iPSCs from adult peripheral blood samples. The generated iPSCs are integration-free as residual episomal plasmids are undetectable after five passages. Although the reprogramming efficiency is comparable to that of Sendai Virus (SV) vectors, EV plasmids are considerably more economical than the commercially available SV vectors. This affordable EV reprogramming system holds potential for clinical applications in regenerative medicine and provides an approach for the direct reprogramming of PB MNCs to integration-free mesenchymal stem cells, neural stem cells, etc.

This protocol describes a detailed method for efficient generation of integration-free iPSCs from human adult peripheral blood cells. With the use of four oriP/EBNA-based episomal vectors to express the reprogramming factors, KLF4, MYC, BCL-XL, or OCT4 and SOX2, thousands of iPSC colonies can be obtained from 1 mL of peripheral blood.

에피 솜 벡터를 이용하여 인간 말초 혈액 단핵 세포로부터의 통합없이 유도 다 능성 줄기 세포의 생성

Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) hold great promise for disease modeling and regenerative therapies. We previously reported the use of Episomal ...

Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

정의 및 간세포와 같은 세포의 확장 성 생성 인간 다 능성 줄기 세포에서

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

말초 혈액 유래 인간 유래 다 능성 줄기 세포에서 연골 세포 분화

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. Efforts to study human cerebral cortex development have been limited by the availability of model systems. Translating results from rodent studies to the human system is restricted by species differences and studies on human primary tissues are hampered by a lack of tissue availability as well as ethical concerns. Recent development in human pluripotent stem cell (PSC) technology include the generation of three-dimensional (3D) self-organizing organotypic culture systems, which mimic to a certain extent human-specific brain development in vitro. Currently, various protocols are available for the generation of either whole brain or brain-region specific organoids. The method for the generation of homogeneous and reproducible forebrain-type organoids from induced PSC (iPSC), which we previously established and describe here, combines the intrinsic ability of PSC to self-organize with guided differentiation towards the anterior neuroectodermal lineage and matrix embedding to support the formation of a continuous neuroepithelium. More specifically, this protocol involves: (1) the generation of iPSC aggregates, including the conversion of iPSC colonies to a confluent monolayer culture; (2) the induction of anterior neuroectoderm; (3) the embedding of neuroectodermal aggregates in a matrix scaffold; (4) the generation of forebrain-type organoids from neuroectodermal aggregates; and (5) the fixation and validation of forebrain-type organoids. As such, this protocol provides an easily applicable system for the generation of standardized and reproducible iPSC-derived cortical tissue structures in vitro.

Cerebral organoids represent a new model system to investigate early human brain development in vitro. This article provides the detailed methodology to efficiently generate homogeneous dorsal forebrain-type organoids from human induced pluripotent stem cells including critical characterization and validation steps.

인간에서 표준화 되 고 재현 가능한 개 타입 대뇌 Organoids의 생성 유도 만능 줄기 세포

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...