우리의 프로토콜은 개발 중 FMRP의 세포 자율 기능을 조사하는 생체 내 방법입니다. 이것은 취약 X 증후군의 세포 유형 특이적 병태생리학을 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 방법은 Fmr1 작은 헤어핀 RNA를 포함하는 약물 유도성 벡터 시스템의 스테이지, 부위 및 방향 특이적 전기천공을 사용합니다.
이 방법을 사용하면 청각 회로에서 선택적 FMRP 녹다운을 달성합니다. 이 방법은 청각 회로나 전정계에서 다른 유전자의 기능을 조사하는 데에도 적용할 수 있습니다. 쉽게 조작할 수 있도록 난자를 난자 상단에 배치하기 위해 난자를 수평으로 배치하는 것으로 시작합니다.
신경관 형질감염을 위해 햄버거와 해밀턴 또는 HH 단계 12가 될 때까지 섭씨 38도에서 46 내지 48시간 동안 배양하고, 이낭 형질감염을 위해 HH 13까지 54 내지 56시간 동안 배양한다. 인큐베이터에서 한 번에 12 개의 알을 제거하십시오. 알을 인큐베이터에서 1시간 이상 방치하면 발달 변화가 발생하고 생존력이 감소합니다.
손전등을 사용하여 계란 바닥에서 빛을 비추십시오. 배아의 위치는 달걀 껍질에 어두운 영역으로 나타납니다. 달걀 껍질에 배아의 위치를 연필로 표시하십시오.
75 % 에탄올이 함유 된 거즈로 계란을 닦고 가위 끝을 사용하여 계란의 뾰족한 끝에 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 18 게이지 바늘 주사기로 2 밀리리터의 알부민을 제거하십시오. 구멍이 바늘 삽입을 허용할 만큼만 큰지 확인하십시오.
새는 알부민을 거즈로 닦아내고 투명 테이프로 구멍을 막으십시오. 연필로 표시된 어두운 부분을 중심으로 투명 테이프로 계란 상단을 덮어 균열을 최소화하고 창 작업 중에 떨어지는 껍질 파편을 방지합니다. 75 % 에탄올이 함유 된 거즈로 모든 수술 도구를 닦고 테이프로 덮인 부위를 75 % 에탄올로 닦으십시오.
작은 가위를 사용하여 연필 자국 둘레에 1-2 평방 센티미터의 창을 자릅니다. 아래의 배아가 손상되지 않도록 가위를 평평하게 잡으십시오. 창이 있는 달걀을 10X 접안렌즈와 2X 줌이 있는 실체 현미경 아래에 놓습니다.
1 밀리리터 주사기에 잉크 용액을 채운 다음 27 게이지 바늘을 맞 춥니 다. 집게로 바늘을 45도 각도로 구부립니다. 현미경으로 불투명 한 부위의 가장자리에서 조심스럽게 찌르고 배아 아래에 바늘을 삽입하십시오.
배아 시각화를 위해 pellucida 영역 아래로 확산되는 약 50 마이크로 리터의 잉크를 주입합니다. 잉크는 배아의 명확한 시각화를 위해 어두운 배경을 형성합니다. 피펫 풀러를 사용하여 유리 모세관을 피펫으로 당깁니다.
해부 현미경으로 모세 혈관 바늘의 끝을 집게로 직경 10-20 마이크로 미터로 조심스럽게 엽니 다. 사용할 때까지 피펫을 보관 상자에 보관하십시오. 다음으로, 피펫 끝에 있는 고무 튜브를 통해 부압을 인가하여 0.5 내지 1 마이크로리터의 플라스미드 혼합물로 모세관 피펫을 주사기로 채운다.
배아가 꼬리를 가까이에 두고 수직으로 향하도록 현미경 아래에 알을 놓습니다. 한 손으로 또는 3축 매니퓰레이터로 모세관 피펫을 잡고 피펫 끝을 마름모꼴 5-6으로 구동합니다. 꼬리에서 머리 방향으로.
팁을 vitellin 막을 통해 등쪽 신경관으로 부드럽게 찌른 다음 피펫을 약간 빼서 팁이 신경관의 내강에 있도록 합니다. 착색된 플라스미드가 마름모꼴 5 내지 6으로 완전히 확산되고 마름모꼴 3 및 마름모꼴 4로 확장될 때까지 기압을 가하여 플라스미드 혼합물을 주입한다. 파란색 플라스미드 용액이 누출 없이 신경관 아래로 빠르게 확산될 때 달성되는 성공적인 주입을 확인하십시오.
누출이 발생하면 파란색이 빠르게 사라집니다. 주사 직후, 백금 양극성 전극을 신경관의 양쪽에 놓습니다. 전기 천공기로 12V 및 50 밀리 초 지속 시간의 두 펄스를 제공합니다.
양극성 전극의 끝에서 기포를 관찰하고 음극에 더 많은 것을 관찰하십시오. 착색 된 플라스미드 혼합물이 전극의 양극 근처의 신경관 조직으로 들어갈 때 달성되는 성공적인 전기 천공을 확인하십시오. 전기 천공 후 바이폴라 전극을 조심스럽게 제거하십시오.
달걀 껍질의 창을 2 인치 정사각형으로 미리 자른 투명 필름 조각으로 덮고 75 % 에탄올을 뿌립니다. 계란을 인큐베이터에 다시 넣으십시오. 다음 계란으로 진행하기 전에 식염수에서 12볼트와 50밀리초 지속 시간의 10-20펄스를 전달하여 양극성 전극을 청소하십시오.
현미경으로 배아가 꼬리가 근처에 수직이되도록 계란을 놓습니다. 모세관 피펫을 잡고 오른쪽 이낭을 배측 방향으로 부드럽게 찌릅니다. 이낭이 파란색 용액으로 채워질 때까지 플라스미드 혼합물을 공기 압력으로 주입하십시오.
파란색 플라스미드 혼합물이 이낭 내에 갇혀 누출되지 않을 때 달성되는 성공적인 주사를 확인하십시오. 주사 직후, 이낭에 양극성 전극을 놓고 양극과 음극을 각각 이낭의 앞쪽과 뒤쪽에 위치시킵니다. 전기 천공기로 12V 및 50 밀리 초 지속 시간의 두 펄스를 제공합니다.
파란색 플라스미드 혼합물이 전극의 양극 근처의 이낭 조직에 들어갈 때 달성되는 성공적인 전기 천공을 확인하십시오. 전기 천공 후 바이폴라 전극을 조심스럽게 제거하고 달걀 껍질의 창을 투명 필름으로 덮으십시오. 마지막으로 계란을 인큐베이터로 되돌립니다.
대표 이미지는 배아 2일째 또는 E2에서 신경관 형질감염 및 신상 털기 치료 후 배아 3일째 또는 E3의 예를 보여줍니다. 단면에 Fmr1 shRNA 및 EGFP를 갖는 형질감염된 세포가 여기에 도시되어 있다. EGFP 발현 세포는 신경관과 뇌간의 한쪽에 국한되었습니다. 형질감염된 쪽에 EGFP 발현 핵 마그노셀룰라리스 또는 NM 뉴런이 있는 E15의 단면이 여기에 표시됩니다.
반대쪽 측면에서, EGFP 함유 축삭은 핵 층판 또는 NL의 복부 부분에서 보였다. Fmr1 shRNA의 녹다운 효과는 인접한 비형질감염된 뉴런과 비교하여 형질감염된 NM 뉴런에서 FMRP 면역 반응성의 현저한 감소에 의해 검증되었습니다. FMRP 면역 반응성을 갖는 E19의 청각 신경절이 여기에 표시됩니다. 청각 신경절 뉴런은 형질감염되지 않았다.
두개골 신경 볏 세포로부터 유래된 일부 신경교 세포를 형질감염시켰다. 대표적인 이미지는 이낭 형질감염 후 청관의 FMRP 녹다운을 보여줍니다. E9의 청각 덕트는 광범위한 EGFP 형광을 나타냈다.
횡단면에서, EGFP- 발현 세포는 기저 유두와 청각 신경절에 위치했다. Fmr1 shRNA의 녹다운 효과는 인접한 형질주입되지 않은 유모 세포와 비교하여 형질감염된 유모 세포에서 감소된 FMRP 면역반응에 의해 검증되었습니다. 유사하게, FMRP 면역 반응성은 형질 전환 된 청각 신경절 뉴런에서 크게 감소했다.
형질감염된 청각 신경절 뉴런의 중앙 투영은 특성화된 말단 말단이 있는 청각 신경을 통해 뇌간으로 추적되었습니다. 이 절차를 시도하는 동안 가장 중요한 것은 선택적 형질 주입을위한 전기 천공 부위와 방향을 제어하는 것입니다. 이 절차에 따라 단일 세포 유형 충전, 면역 염색, 질량 스펙트럼에 따른 세포 분류 또는 단일 세포 시퀀싱을 수행하여 형태학적 및 생화학적 수준에서의 변화를 나타낼 수 있습니다.
이 기술은 또한 줄기 회로에 대한 청각 귀에서 시간적 제어 및 구성 요소 특이성을 가진 다른 유전자의 선택적 편집을 가능하게 하고 전정 시스템을 조작하도록 수정할 수 있습니다.
